清宣止咳顆粒止咳、祛痰、抗炎作用評價

梁 婷， 黃 露， 曹征宇

(中國藥科大學中藥學院，江蘇 南京 211198)

咳嗽是呼吸系統常見癥狀之一，是保持呼吸道通暢和保護肺部免受潛在有害物質侵害的一種防御性反射[1]。上呼吸道感染或普通感冒是咳嗽最常見的原因，感染后咳嗽、不明原因的慢性咳嗽、以及由哮喘、慢性阻塞性肺病、特發性肺纖維化和肺癌等肺部疾病也會引起咳嗽[2]。咳嗽按照持續時間的長短分為急性咳嗽、亞急性咳嗽及慢性咳嗽[2-5]。目前市場上的止咳藥物主要分為中樞性鎮咳藥物和外周性鎮咳藥物[6]，如中樞作用的止咳藥通常有神經副作用，如鎮靜和產生依賴性，因此常常被限制使用[7]。非處方(OTC)藥常被用作急性咳嗽的一線治療藥物，但是由于目前缺乏充分的臨床研究證明OTC藥止咳的療效[8]，因此評價市售OTC藥的止咳療效是現在亟待解決的問題。

清宣止咳顆粒是由張珍玉教授在民間驗方的基礎上研制而成的純中藥制劑，方中桑葉甘苦性涼，薄荷辛涼，疏風散熱共為君藥；杏仁、枳殼苦降，桔梗辛散，祛咳止痰共為臣藥；紫菀味苦溫而不熱，白芍味酸斂陰，陳皮苦溫行滯化痰共為佐藥；甘草調和諸藥為使藥[9]。目前為止，對于清宣止咳顆粒的臨床療效研究證明其確可縮短小兒急性支氣管炎(外感風熱型咳嗽)病程，但其祛咳、止痰、抗炎的基礎研究報道較少，作用機制還有待深入研究。本研究根據清宣止咳顆粒的功能主治，結合小兒外感風熱咳嗽的臨床表現[10-15]，建立整體動物模型對清宣止咳顆粒的止咳、祛痰、抗炎作用進行評價，為清宣止咳顆粒的臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 試劑與藥物 清宣止咳顆粒(江蘇蘇中藥業集團股份有限公司，批號08120316)；復方甘草片(南京白敬宇制藥有限責任公司，批號20180308)。0.9%氯化鈉注射液(華潤雙鶴藥業股份有限公司，批號200707)；脂多糖(美國Sigma公司，批號1001003477)；地塞米松[阿拉丁試劑(上海)有限公司，批號07408]；髓過氧化物酶(MPO)測試盒(比色法)(南京建成生物工程研究所，貨號A044-1-1)；白介素-1β(IL-1β)檢測試劑盒(南京金益柏生物科技有限公司，貨號JEB-12787)。氨水(南京南試化學試劑有限公司，批號170213)；氯化銨、苯酚紅(西隴化工股份有限公司，批號160121、170416)；氫氧化鈉(西隴科學股份有限公司，批號141121)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司，批號161011)。

1.2 動物 SPF級ICR小鼠，雄性，8周齡，體質量21～25 g，購自南京市江寧區青龍山動物繁殖場，動物使用許可證號SYXK 2016-0011。所有實驗方案均得到中國藥科大學動物倫理和使用委員會批準。

1.3 儀器 紫外分光光度計(日本島津公司，型號UV-2550)；分析天平(萬分之一，美國奧豪斯公司，型號PX224ZH/E)；超聲振蕩器(濟寧亨達超聲設備有限公司，型號PS-20T)；尼康顯微鏡(日本尼康公司，型號MA-100)。

2 方法

2.1 小鼠氨水引咳模型建立

2.1.1 分組與給藥 60只雄性ICR小鼠適應性喂養2～3 d后，按照體質量隨機分為空白組，模型組，清宣止咳顆粒1、2.5、5 g/kg組，復方甘草片組，每組10只，分別灌胃給予蒸餾水、清宣止咳顆粒和復方甘草片(0.12 g/kg)，給藥量均為0.2 mL/10 g。

2.1.2 造模 按“2.1.1”項下方法分組并給藥1 h后，在倒扣500 mL燒杯中放入1個棉球，注入300 μL 25%氨水，飽和1 min后迅速將小鼠放入其中，45 s后取出，放于另1個倒扣的干凈500 mL燒杯中，觀察典型咳嗽動作(腹肌收縮，同時張大嘴，有咳聲)，記錄咳嗽潛伏期(從取出開始計時到第1次咳嗽的時間)及5 min內咳嗽次數。觀察結束后，收集小鼠肺組織進行HE染色及病理評價。空白組小鼠不給予氨水刺激，直接取下肺組織進行病理評價。

2.2 小鼠氣管泌紅模型建立

2.2.1 分組與給藥 60只雄性ICR小鼠適應性喂養2～3 d后，按照體質量隨機分為空白組，模型組，清宣止咳顆粒1、2.5、5 g/kg組，氯化銨組，每組10只，分別灌胃給予蒸餾水、清宣止咳顆粒、氯化銨(1 g/kg)，給藥量均為0.2 mL/10 g。

2.2.2 造模 按“2.2.1”項下方法分組并給藥4 d，末次給藥30 min后除空白組小鼠腹腔注射生理鹽水外，其余各組小鼠腹腔注射5%酚紅(生理鹽水溶解，加入1 mol/L NaOH助溶)，注射量為0.1 mL/10 g，30 min后脫頸椎處死小鼠，剝去氣管周圍組織，剪下自甲狀軟骨至氣管分支處的一段氣管，放入盛有2 mL生理鹽水、0.1 mL 1 mol/L NaOH的試管中，超聲振蕩30 min，以上述混合溶液為空白對照，采用紫外分光光度計于546 nm處波長測定吸光度，以吸光度與氣管質量的比值分析祛痰效果。

2.3 小鼠急性肺損傷模型建立

2.3.1 分組與給藥 48只雄性ICR小鼠隨機分為假手術組，脂多糖組，脂多糖+清宣止咳顆粒1、2.5、5 g/kg組，地塞米松組，每組8只，分別灌胃給予蒸餾水、清宣止咳顆粒、地塞米松(5 mg/kg)，給藥量均為0.2 mL/10 g。

2.3.2 造模 小鼠灌胃給藥1 h后，4%水合氯醛(0.1 mL/10 g)麻醉，將頭后仰固定在自制的木板上，頸部脫毛，局部碘伏消毒，切開頸部正中皮膚，切口長約1 cm，鈍性分離皮下組織及肌肉，暴露氣管，將輸液器針頭經氣管前壁插入氣管內。脂多糖組、清宣止咳顆粒不同劑量組、地塞米松組小鼠氣管內滴注脂多糖溶液(5 mg/kg)，采用注射器沖入約1 mL空氣，以確保脂多糖溶液全部進入小氣道及肺泡腔；假手術組小鼠滴注等體積生理鹽水，滴入完成后縫合切口，放在溫暖環境中復蘇。

2.3.3 肺泡灌洗液(BALF)收集 小鼠氣管內滴注脂多糖/生理鹽水6、24 h后，頸椎脫臼法處死，固定在自制木板上，打開胸腔，暴露氣管及雙肺，手術線結扎左肺門，沿氣管前壁插入10 mL注射器磨平的針頭，并用絲線將其固定在氣管內，結扎針頭兩端，注射器針頭每次注入生理鹽水0.5 mL，反復沖洗3～5次，將沖洗液吸出，再注入新生理鹽水，同法灌洗支氣管肺泡2次，回收率約為80%。將回收的BALF立即放入低溫高速離心機中，4 ℃、3 000 r/min離心5 min，取上清液，保存于-80 ℃冰箱中。

2.3.4 肺組織勻漿液制備 將小鼠左肺下葉組織用預冷的生理鹽水漂洗，洗去血液，濾紙吸干，稱定質量，在冰水浴中剪碎，加入組織質量9倍的冷生理鹽水研磨勻漿，將勻漿液轉移到EP管中，放于冰上供后續指標測定。

2.3.5 肺組織勻漿液及BALF中MPO水平檢測 取“2.3.3”“2.3.4”項下小鼠肺組織勻漿液及BALF，按照相關檢測試劑盒說明書操作檢測MPO水平。

2.3.6 BALF中IL-1β水平檢測 取“2.3.3”項下小鼠BALF，按照相關檢測試劑盒說明書操作檢測IL-1β水平。

2.4 HE染色檢測小鼠肺組織病理變化 取小鼠左肺上葉組織，放入裝有4%多聚甲醛的離心管中固定24 h，送至江蘇省藥物安全性評價中心病理室包埋切片，HE染色，并進行單盲病變評分。根據病變由輕到重的程度，依次定量為0分，正常；0.5分，輕微或極少量；1分，輕度或少量；2分，中度或較多；3分，重度或多量；4分，極重度或大量，累加分數，計算平均值，分值越高，損傷程度越嚴重。

3 結果

3.1 清宣止咳顆粒對氨水引咳小鼠的鎮咳作用

3.1.1 咳嗽次數、咳嗽潛伏期 空白組小鼠由于無刺激源未見顯著咳嗽反應，故咳嗽次數記為0，咳嗽潛伏期記為300 s。如圖1所示，與空白組比較，模型組小鼠咳嗽次數增加，咳嗽潛伏期縮短(P<0.01)；清宣止咳顆粒1、2.5、5 g/kg組能減少300 s內的咳嗽次數，使咳嗽潛伏期延長(P<0.01)。

3.1.2 HE染色、病理評分 如圖2所示，與模型組比較，清宣止咳顆粒干預后能有效減少小鼠肺部充血、炎細胞浸潤等病變(P<0.01)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖2 氨水引咳模型中各組小鼠肺組織HE染色(A)和病理評分Fig.2 HE staining (A) and pathological scores (B) for lung tissues of mice in ammonia-induced cough model

3.2 清宣止咳顆粒對氣管泌紅小鼠的祛痰作用 如圖3所示，與模型組比較，清宣止咳顆粒干預后能劑量依賴性地增加小鼠氣管內酚紅的排泌量，劑量為5 g/kg時效果最好(P<0.05)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖3 各組小鼠氣管內酚紅排泌量Fig.3 Tracheal excretions of phenol red of mice in each

3.3 清宣止咳顆粒對脂多糖氣管滴注誘導急性肺損傷小鼠的影響

3.3.1 HE染色、病理評分 如圖4所示，脂多糖氣管滴注24 h后，與空白組比較，脂多糖組小鼠肺組織出現大范圍的病變，表現為肺泡壁輕度或中度充血、出血，肺泡壁有中性粒細胞和單核巨噬細胞等炎細胞浸潤，肺泡壁出現肺氣腫，肺泡腔增大，肺內支氣管上皮細胞出現變性等病變(P<0.01)；與脂多糖組比較，清宣止咳顆粒給藥后能減輕小鼠肺部充血、炎細胞浸潤等病變(P<0.01)。

3.3.2 BALF和肺組織中MPO活性、IL-1β水平 如圖5所示，與脂多糖組比較，清宣止咳顆粒各劑量組小鼠BALF和肺組織中MPO活性降低(P<0.05，P<0.01)，BALF中IL-1β水平降低(P<0.01)。

注：與空白組比較，##P<0.01；與脂多糖組比較，**P<0.01。圖4 急性肺損傷模型中各組小鼠肺組織HE染色(A)和病理評分Fig.4 HE staining (A) and pathological scores (B) for lung tissues of mice in acute lung injury model

注：與空白組比較，##P<0.01；與脂多糖組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 各組小鼠BALF和肺組織中MPO活性(A、B)和BALF中IL-1β水平Fig.5 MPO activity (A, B) in BALF and lung tissues and IL-1β level (C) in BALF of mice in each

4 討論

氨水是一種具有刺激性的化學物質，小鼠吸入氨水后即可引發咳嗽。本研究顯示，劑量為1、2.5、5 g/kg的清宣止咳顆粒單次灌胃給藥后，都能有效減少5 min內的咳嗽次數，延長咳嗽潛伏期，5 g/kg劑量效果顯著。本研究還考察了藥物對氨水引起的急性肺部損傷的保護作用，病理結果表明，清宣止咳顆粒能有效減少小鼠肺部充血、炎細胞浸潤等病變。提示清宣止咳顆粒具有良好的鎮咳、祛痰作用，與其臨床常用于治療小兒外感風寒咳嗽應用相一致。

大多數祛痰藥物都能增加呼吸道分泌物，稀釋呼吸道痰液，使其容易隨纖毛運動通過咳嗽發射咳出[16]。在本實驗中，通過檢測氣管內酚紅的排泌量，來考察清宣止咳顆粒對痰液分泌的影響。實驗結果表明，當連續多次給藥后，5 g/kg清宣止咳顆粒能增加氣管內酚紅排泌量。提示，清宣止咳顆粒多次給藥有較好祛痰效果。感染和組織損傷是炎癥發生的主要誘因，先天免疫系統細胞如中性粒細胞和巨噬細胞的浸潤是急性炎癥的特征，目前脂多糖氣管滴注是研究肺部感染引起急性肺損傷的主要模型[17]。本研究使用脂多糖氣管滴注成功地復制了急性肺損傷模型，研究結果顯示給予清宣止咳顆粒能夠顯著改善急性肺損傷模型中小鼠肺泡壁充血，嗜中性粒細胞和單核巨噬細胞等炎細胞浸潤，肺內支氣管上皮細胞變性，肺泡腔增大，局部肺泡壁破壞、融合等病變。已有報道表明，清宣止咳顆粒可通過抑制咳嗽模型大鼠腹主動脈炎癥因子IL-4、IL-8及TNF-α水平，從而抑制氣道炎癥與高反應[17]。清宣止咳顆粒還可降低咳嗽模型大鼠血清中IgE、LTC-4水平，升高IFN-γ水平，調節機體免疫功能紊亂，抑制或阻斷氣道慢性炎癥反應[18]。

重癥咳嗽患者的肺泡灌洗液、肺泡組織中存在活化的中性粒細胞增多與浸潤，可分泌MPO、白介素等炎癥反應標志物。本研究進一步證明清宣止咳顆粒能夠抑制脂多糖誘導急性肺損傷模型小鼠BALF和肺組織中MPO活性的增加，并減少BALF中IL-1β水平。MPO作為中性粒細胞活化的自分泌調節劑，長期以來被認為與組織損傷有關，清宣止咳顆粒給藥組咳嗽大鼠的MPO活性降低表明清宣止咳顆粒可能抑制炎癥細胞的浸潤從而減輕肺組織損傷[18]。脂多糖通過Toll樣受體4誘導促炎細胞因子如TNF-α的快速釋放，激活多種下游效應因子如IL-1β和IL-6的產生，從而放大炎癥反應，清宣止咳顆粒給藥組大鼠BALF中IL-1β水平的減少可反映清宣止咳顆粒的抗炎作用[8]。由此可知，清宣止咳顆粒通過抑制MPO活性和IL-1β水平緩解急性炎癥，這可能是清宣止咳顆粒治療咳嗽的重要作用機制。

綜上所述，清宣止咳顆粒能夠抑制氨水引起的小鼠急性咳嗽，促進酚紅排泌，其治療咳嗽、祛痰、抗炎的機制可能是通過抑制急性肺損傷大鼠炎癥因子的釋放，減輕炎癥反應。