丹梔龍膽逍遙湯成分復配物的抗炎作用

張 藝， 耿亞飛， 鄭博文， 楊 成， 趙炳天*

(1.江南大學化學與材料工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學合成與生物膠體教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

特應性皮炎，又稱特應性濕疹，是一種慢性復發性皮膚炎癥，臨床表現為反復的濕疹和強烈的瘙癢。特應性皮炎好發于兒童期，但在成人中也很常見[1]。特應性皮炎的發病機制還未完全闡明，其特征性表現為免疫球蛋白E(IgE)抗體水平升高，肥大細胞(MCs)浸潤[2]。MCs可通過產生IL-6調節免疫反應[3]，在特應性皮炎患者中能觀察到外周血T細胞中白細胞介素-6(IL-6)的分泌增多[4]， 血清和皮膚中有較高水平的TNF-α[5]，還可檢測到前列腺素(PGE2)、環氧合酶(COX-2)水平的升高[6]，一氧化氮合酶(iNOS)表達的上調[7-8]及NF-κB的激活[9]。特應性皮炎的局部外用藥物以糖皮質激素和鈣調磷酸酶抑制劑為主，但局部皮膚灼熱、瘙癢、紅斑和腎毒性等副作用限制了藥物的長期使用[10]。因此從天然藥物中開發毒副作用較小的抗炎藥物，是目前研究的熱點。

丹梔龍膽逍遙湯是在逍遙散的基礎上增加了丹皮、梔子和龍膽三種中藥，增加了清熱涼血的功效。Zhang等[11]研究了蟾蜍皮中總吲哚烷胺類生物堿的抗炎機制，蟾蜍皮具有清熱涼血和解毒的功效，清熱涼血與現代醫學的抗炎免疫觀念密切相關，因此推測丹皮、梔子和龍膽在配方中主要起抗炎作用。通過文獻檢索，選取3種植物的主要成分進行篩選，以NO清除率為指標選出了各植物中活性最好的組分。獐牙菜苦苷是龍膽的主要活性成分，具有抗炎、免疫調節、鎮痛、鎮靜和解痙等作用[12]；京尼平苷酸是梔子的重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗心血管疾病等作用[13]；沒食子酸是丹皮中的主要活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒等作用[14]。本文研究了丹梔龍膽逍遙湯中抗炎成分獐牙菜苦苷、京尼平苷酸和沒食子酸復配物在脂多糖(LPS)誘導的RAW264.7細胞炎癥和2，4-二硝基氯苯(DNCB)誘導的小鼠特應性皮炎的抗炎效果。

1 材料

1.1 細胞與動物 小鼠巨噬細胞系RAW264.7購自北京北納創聯生物技術研究院。36只SPF級雄性BALB/c小鼠，5～6周齡，體質量15～20 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物生產許可證號SCXK(滬)2017-0005，合格證編號20170005029546，飼養于江南大學，飼養條件為溫度22～25 ℃，相對濕度35%～75%，12 h/12 h明暗交替。

1.2 試劑與藥物 獐牙菜苦苷、京尼平苷酸、沒食子酸(純度>98%)均購自南京狄爾格醫藥科技有限公司。2，4-二硝基氯苯(DNCB)、噻唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司；DMEM高糖培養基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、青霉素和鏈霉素溶液均購自美國Hyclone 公司；胎牛血清購自澳洲Ausgenex公司；脂多糖(LPS)購自北京索萊寶科技有限公司；NO試劑盒購自美國BioVision公司；HE染色試劑盒、甲苯胺藍染色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司；IgE小鼠試劑盒、PGE2小鼠ELISA試劑盒、iNOS小鼠ELISA試劑盒、COX-2小鼠ELISA試劑盒均購自英國Abcam公司；IL-6小鼠ELISA試劑盒、TNF-α小鼠ELISA試劑盒均購自美國R&D公司；BCA試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、PVDF膜、超敏ECL發光試劑盒、GAPDH 抗體均購自上海碧云天生物技術有限公司；NF-κB p65、p-IκBα抗體均購自美國CST公司。

2 方法

2.1 細胞培養與存活率檢測 RAW264.7細胞用含10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM完全培養基培養， 置于37 ℃、5%CO2培養箱中，每天傳代1次，取對數期細胞用于實驗。每孔以1×104個細胞接種于96孔板中，培養12 h后棄液，設置空白組(培養基)、對照組(細胞+培養基)、LPS組(1 μg/mL LPS)、實驗組(不同質量濃度的單體以及復配物)，加藥體積為100 μL，每組設6個復孔，培養24 h后棄液。加入100 μL無血清培養基配制的MTT(0.5 mg/mL)孵育4 h，棄液，PBS洗2次。加入100 μL DMSO，振蕩溶解5 min，酶標儀490 nm波長處測定吸光度(A)，計算細胞存活率，公式為存活率=[(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)] ×100%。

2.2 NO釋放量檢測 每孔以1×106個細胞接種于6孔板中，培養12 h后換液，加入LPS和不同質量濃度的復配物(50、100、200 μg/mL)，每組設置3個復孔，共同孵育24 h，取上層培養基，13 000 r/min離心5 min，吸取上清。采用相關ELISA試劑盒，按照說明書操作檢測上清液中NO水平。

2.3 細胞因子、PGE2水平檢測 每孔以1×106個細胞接種于6孔板中，按“2.2”項下方法處理、培養細胞，每組3個復孔。采用相關ELISA試劑盒，按照說明書操作檢測上清液中IL-6、TNF-α、PGE2水平。

2.4 iNOS、COX-2水平檢測 每孔以8×105個細胞接種于6孔板中，培養12 h后換液，加入50、100、200 μg/mL的復配物預處理2 h后換液，加入LPS孵育22 h，棄上清，冷PBS洗滌2次，使用含蛋白酶抑制劑的強RIPA裂解液于冰上裂解蛋白，13 000 r/min離心10 min，取上清，按照BCA試劑盒操作檢測蛋白濃度并調整至同一濃度。采用相關ELISA試劑盒，檢測iNOS、COX-2水平。

2.5 Western blot檢測NF-κB p65核易位 取4×106個RAW264.7細胞接種于60 mm直徑的培養皿中，培養結束后棄上清，冷PBS洗2次，使用NE-PERTM核和細胞質提取試劑盒裂解提取細胞不同部位的蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度，沸水浴5 min滅活蛋白，8%SDS-PAGE凝膠電泳分離30～75 kDa的蛋白，6%SDS-PAGE凝膠電泳分離75～180 kDa蛋白，200 mA濕轉120 min后將蛋白轉移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1.5 h，分別加入一抗p-IκB-α、NF-κB p65，4 ℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min，使用ECL發光液顯影。

2.6 細胞免疫熒光分析 參考文獻[15]報道的方法，取2×105個RAW264.7細胞接種于共聚焦小皿中，細胞貼壁后加入復配物(200 μg/mL)孵育1 h，換液加入LPS(1 μg/mL)刺激30 min。吸干凈培養基，加入PBS稀釋的4%甲醛，室溫固定細胞15 min，吸去固定液，PBS洗3次，每次5 min，加入細胞封閉液封閉標本1 h，封閉結束后加入NF-κB p65，4 ℃孵育過夜，PBS洗3次，加入FITC標記二抗，室溫避光孵育1.5 h，PBS洗3次，加入DAPI染液避光孵育5 min，PBS洗3次，使用共聚焦顯微鏡拍攝熒光圖片。

2.7 DNCB誘導小鼠炎癥模型建立 小鼠隨機分為6組，分別為溶劑組、模型組、DNCB+0.25%復配物組、DNCB+0.5%復配物組、DNCB+1%復配物組、地塞米松(0.1%)組，每組6只，適應性培養1周后，在實驗前1天(第0天)用剃須刀剃除小鼠背部區域內毛發，在造模致敏階段，第1、4天用微量移液器與毛刷配合，將150 μL 1.0%DNCB均勻涂抹于造模小鼠背部剃除毛發區域，溶劑組小鼠僅在實驗期間背部涂抹溶劑丙酮、橄欖油體積比為3∶1。在造模激發階段，從第7天開始將100 μL 0.5%DNCB均勻涂抹于造模小鼠背部剃除毛發區域，在第10、13、16、19、22天重復上述刺激。從第10天起開始給藥，取不同質量濃度的復配物藥液各100 μL，涂抹于DNCB+復配物組小鼠誘導部位皮膚，每天1次，地塞米松組每天給予1次100 μL地塞米松。第23天，小鼠眼球摘除取血，脫頸處死，取病灶部位皮膚。

2.8 組織學觀察及IgE水平檢測 將小鼠背部皮膚用4%中性福爾馬林固定，制備4 μm厚石蠟切片，蘇木精-伊紅(HE)染色評估表皮厚度，甲苯胺藍染色評估皮膚組織肥大細胞數量，ELISA試劑盒檢測血清IgE水平。

3 結果

3.1 復配物對RAW264.7細胞存活率的影響 如圖1A所示，沒食子酸、京尼平苷酸、獐牙菜苦苷質量濃度分別在25、25、200 μg/mL時對RAW264.7細胞的存活率無顯著性影響(P>0.05)，故確定三者復配比為8∶1∶1。如圖1B所示，在LPS刺激下，RAW264.7細胞經0～200 μg/mL復配物處理24 h后，其存活率無明顯變化(P>0.05)。因此，選擇50～200 μg/mL質量濃度檢測抗炎效果。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖1 單體及其復配物對RAW264.7細胞存活率的影響Fig.1 Effects of compounds and compound formula on RAW264.7 cells

注：與對照組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 復配物對LPS誘導 RAW264.7細胞TNF-α、IL-6水平的影響Fig.2 Effects of compound formula on levels of TNF-α and IL-6 in LPS-induced RAW264.7

3.2 復配物對RAW264.7細胞上清液中IL-6、TNF-α水平的影響 如圖2所示，與對照組比較，LPS組細胞上清液中IL-6、TNF-α水平升高(P<0.01)；與LPS組比較，不同質量濃度復配物處理后細胞上清液中IL-6、TNF-α水平降低(P<0.05，P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.3 復配物對RAW264.7細胞上清液中NO、PGE2水平及細胞中iNOS、COX-2水平的影響 如圖3A～3C所示，與對照組比較，LPS組細胞上清液中NO、PGE2水平及細胞中iNOS、COX-2水平均升高(P<0.01)；與LPS組比較，復配物處理后細胞上清液中NO、PGE2水平及細胞中iNOS、COX-2水平均降低(P<0.01)，并呈劑量依賴性。

3.4 復配物對RAW264.7細胞NF-κB核易位的影響 如圖4A所示，隨著LPS刺激時長的增加，細胞核內NF-κB p65表達先升高后降低，而細胞質中其表達恰好相反，同時p-IκB-α表達趨勢與細胞核中NF-κB p65表達一致，表明復配物處理抑制了NF-κB由細胞質向細胞核的轉移。如圖4B所示，對照組細胞NF-κB p65的綠色熒光分布在細胞質中，而LPS刺激后NF-κB p65向細胞核轉移，細胞核綠色熒光增多；與LPS組比較，LPS+復配物組可以明顯的抑制綠色熒光在細胞核中的富集，證實了復配物處理抑制了NF-κB的核易位。

3.5 復配物對DNCB誘導BALB/c小鼠特應性皮炎樣皮損的影響 如圖5A、5C所示，與溶劑組比較，模型組小鼠皮膚表皮厚度增加(P<0.01)；與模型組比較，復配物可以抑制小鼠皮膚表皮厚度的增加(P<0.05，P<0.01)。如圖5B、5D所示，與溶劑組比較，模型組有大量的肥大細胞出現在真皮層中(P<0.01)；與模型組比較，復配物治療組中的肥大細胞數量減少(P<0.05，P<0.01)，以1%復配物效果更為明顯。如圖5E所示，與溶劑組比較，模型組小鼠血清IgE水平升高(P<0.01)；與模型組比較，1%復配物治療組小鼠血清IgE水平降低(P<0.01)。

注：與對照組比較，##P<0.01；與LPS組比較，**P<0.01。圖3 復配物對RAW264.7細胞上清液中NO、PGE2水平及細胞中iNOS、COX-2表達的影響Fig.3 Effects of compound formula on supernate NO，PGE2 levels, and cellular iNOS，COX-2 levels of RAW264.7

圖4 復配物對LPS誘導的RAW264.7細胞NF-κB核易位的影響Fig.4 Effects of compound formula on LPS-induced NF-κB nuclear translocation in RAW264.7 cells

注：紅色箭頭表示肥大細胞。與溶劑組比較，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖5 復配物對DNCB誘導BALB/c小鼠特應性皮炎樣皮損的影響Fig.5 Effects of compound formula on DNCB-induced atopic dermatitis-like skin lesions in BALB/c

4 討論

特應性皮炎的主要癥狀是瘙癢，由于瘙癢引起的過度抓撓會損傷皮膚屏障，導致皮膚暴露在外部微生物中，如細菌[16]。特應性皮炎的特征性表現為IgE抗體水平升高，1型和2型輔助性T細胞(Th1/Th2)失衡，肥大細胞(MCs)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞等免疫細胞浸潤[2]。MCs緊鄰神經和淋巴血管，其儲存和分泌的炎癥介質不僅可以立即影響周圍的組織，還可以調節周圍的免疫細胞[3]，如通過產生IL-6調節免疫反應。TNF-α是多種免疫細胞產生的促炎細胞因子，也被認為是特應性皮炎的關鍵調節因子[5]。在特應性皮炎皮損中可以檢測到PGE2水平的升高，COX-2抑制劑可以阻斷前列腺素的合成[6]。誘導性iNOS由真皮內皮細胞表達，可催化L-精氨酸生成大量NO[7]，NO是細胞損傷的效應分子，可調節參與炎癥反應的多種細胞釋放炎癥介質[17]。LPS可以誘導巨噬細胞分泌促炎因子如TNF-α、IL-6，提高iNOS和COX-2水平。本文通過建立體外細胞炎癥模型，研究了復配物的抗炎功效和可能的抗炎機制。結果表明不同質量濃度(50、100、200 μg/mL)的復配物對LPS誘導RAW264.7細胞的TNF-α、IL-6、NO、PGE2水平均有抑制作用，并且下調iNOS、COX-2水平。NF-κB參與調節細胞免疫、炎癥和凋亡等多過程的基因轉錄。靜息狀態時，NF-κB與其抑制蛋白IκB結合存在于細胞質中，當受到LPS刺激后，IκB磷酸化后降解，NF-κB轉移到細胞核內參與基因轉錄[18]。本研究結果顯示，加入高質量濃度的復配物還可以抑制LPS誘導的細胞NF-κB核易位，表明復配物在體外細胞炎癥模型中具有保護作用。

此外本研究建立了DNCB誘導的小鼠特應性皮炎模型，以研究復配物的體內抗炎效果。結果顯示，外用復配物可以劑量依賴性地降低小鼠特應性皮炎中肥大細胞數量的增多，高質量濃度的復配物可以有效降低特應性皮炎中的表皮增厚和血清總IgE水平上升，表明復配物在體內炎癥模型中同樣具有良好的抗炎效果。

綜上所述，復配物對LPS誘導的RAW264.7細胞具有顯著的抗炎效果，其作用機制可能是復配物通過抑制NF-κB的核易位從而進一步抑制炎癥細胞因子(TNF-α、IL-6、NO、PGE2)及其相關酶(iNOS、COX-2)的水平。此外，復配物還對DNCB誘導的小鼠特應性皮炎具有明顯的抗炎效果。結果表明復配物在體外和體內炎癥模型中都具有良好的抗炎作用，有潛力進一步發展為特應性皮炎的治療藥物。