滇桂艾納香正丁醇部位HPLC指紋圖譜建立及6種成分測定

馬雯芳， 張秀麗， 姜建萍， 甘潔雪， 林春榕

(廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530200)

滇桂艾納香為菊科植物假東風草Blumeariparia(Bl.) DC.的干燥全株，是常用的民族藥[1-2]，具有通火路、祛風毒，除濕毒，止血，調經的功效，可用于經期提前、產后血崩、風濕骨痛等癥狀[3-5]，藥理研究表明，滇桂艾納香具有抗炎鎮痛、抗菌、止血等生理活性[6-9]，在民間應用廣泛，也作為主要藥物用于常用婦科藥婦血康、伊血安等生產。正丁醇部位是滇桂艾納香發揮止血和凝血作用的主要活性部位[10]，具有較強藥理活性，其活性成分咖啡酸、綠原酸、原兒茶酸是發揮止血作用的活性成分[11]，異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C是發揮抗菌、抗病毒、抗炎作用的主要活性成分[12-14]。本實驗采用HPLC法建立滇桂艾納香正丁醇部位指紋圖譜并測定其原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 6個活性成分的含量，為滇桂艾納香正丁醇活性部位質量評價及相關產品的研發生產提供依據。

1 材料

1.1 儀器 電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Agilent 1260高效液相色譜儀(美國Agilent 公司)；超純水儀。

1.2 試劑 綠原酸(批號110753-201716)、咖啡酸(批號110885-200102)、原兒茶酸(批號110819-201205)購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸A(批號2450535)、異綠原酸B(批號14534613)、異綠原酸C(批號57378720)對照品購自成都麥德生科技有限公司，純度>98%。乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為純化水。

1.3 藥材 滇桂艾納香共12批，經廣西中醫藥大學中藥鑒定教研室蔡毅教授鑒定為菊科植物滇桂艾納香Blumeariparia(BL.) DC.的全草，經干燥粉碎后，過4號篩，具體信息見表1。

表1 樣品信息

2 方法與結果

2.1 色譜條件 AgiLent Zorbax SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)，梯度洗脫(0～5 min，10%A；5～10 min，10%～12%A；10～28 min，12%～15%A； 28～50 min，15%～17%A； 50～80 min，17%～24%A；80～110 min，24%～24%A)；體積流量1.0 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長260 nm；進樣量10 μL。

2.2 供試品溶液制備 稱取樣品(S4)粉末2.0 g，裝入50 mL錐形瓶中，加入70%乙醇20 mL，回流提取60 min，濾液蒸干后加純水10 mL溶解，分別用石油醚、水飽和正丁醇(1∶1)依次萃取，各重復2次，合并正丁醇層，蒸干，甲醇溶解定容至2 mL，即得。

2.3 對照品溶液制備 精確稱取6種對照品，70%甲醇超聲溶解并定容至10 mL，制成含0.012 mg/mL原兒茶酸、0.050 mg/mL綠原酸、0.005 mg/mL咖啡酸、0.793 mg/mL異綠原酸A、1.500 mg/mL異綠原酸B與0.315 mg/mL異綠原酸C的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜建立

2.4.1 精密度試驗 取供試品溶液(S4)，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，以異綠原酸B(7號峰)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0.06%～1.03%，相對峰面積RSD為1.03%～2.61%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗 取供試品溶液(S4)，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以異綠原酸B(7號峰)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0.07%～2.55%，相對峰面積RSD為0.95%～2.83%，表明溶液在24 h內具有良好的穩定性。

2.4.3 重復性試驗 精密稱取樣品(S4)6份，每份2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，以異綠原酸B(7號峰)為參照，測得各共有峰相對保留時間RSD為0.09%～2.17%，相對峰面積RSD為1.98%～2.92%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 對照圖譜生成及共有峰標定 取12批供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，相關數據導入2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件，以S4為參照圖譜，異綠原酸B(7號峰)為參照峰進行全譜峰匹配，疊加指紋圖譜見圖1，以平均數法生成對照指紋圖譜，見圖2。按照文獻[15-18]報道結合對照品進行比對，發現峰1為原兒茶酸，峰2為綠原酸，峰3為咖啡酸，峰7為異綠原酸B，峰8為異綠原酸A，峰9為異綠原酸C，相應對照品色譜圖見圖3，相對峰面積見表2。

圖1 12批樣品HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprints for twelve batches of samples

2.4.5 相似度評價 取各供試品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，相應數據導入國家藥典委員會2012年版《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》軟件進行相似度評價，相似度均大于0.9，結果見表3，可知樣品質量整體上較穩定。

2.4.6 化學計量學研究

2.4.6.1 聚類分析 將各共有峰峰面積的原始數據導入SPSS 23.0軟件，選擇組內聯接方法，以余弦為測量度進行系統聚類，結果見圖4。由此可知，12批樣品可分為2大類，S2、S6、S7為一類，S1、S3、S4、S5、S8、S9、S10、S11、S12為另一類。

圖3 各對照品HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various referencesubstances

表2 各共有峰相對峰面積

表3 12批樣品相似度

圖4 12批樣品聚類分析樹狀圖Fig.4 Cluster analysis dendrogram of twelve batches of samples

2.4.6.2 主成分分析 對12批樣品共有峰峰面積進行標準化處理后，導入SPSS 23.0軟件進行主成分分析，發現前2個主成分特征值分別為11.115、0.488，方差貢獻率分別為92.624%、4.065%，累積方差貢獻率達96.689%，可表示藥材中大部分化學信息。

第一主成分變量的權重值可反映化學成分與藥材質量的相關性[19]。本實驗發現，12個共有峰中第一主成分得分排名前5的為3、11、12、5、8號峰，得分分別為0.910、0.831、0.828、0.820、0.815，可代表藥材中大部分化學信息，載荷矩陣結果見表4。再以2個主成分為變量繪制主成分得分圖，見圖5，可知所得結果與聚類分析一致。

表4 主成分載荷矩陣

圖5 12批樣品主成分分析圖Fig.5 Principal component analysis plot for twelve batches of samples

2.5 6種成分含量測定

2.5.1 線性關系考察 精密吸取對照品溶液適量，稀釋至不同質量濃度，在“2.1”項色譜條件下進樣測定。以各成分質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，結果見表5，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

2.5.2 精密度試驗 取對照品溶液適量，在“2.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為0.03%、0.31%、0.61%、0.31%、0.11%、0.19%，表明儀器精密度良好。

表5 各成分線性關系

2.5.3 重復性試驗 精密稱取樣品(S4)6份，每份2.0 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為2.47%、2.51%、1.65%、2.19%、1.51%、1.52%，表明該方法重復性良好。

2.5.4 穩定性試驗 精密吸取供試品溶液(S4)適量，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C峰面積RSD分別為1.82%、2.44%、2.76%、2.68%、2.68%、2.77%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗 精密稱取樣品(S4)6份，加入對照品，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，測得原兒茶酸、綠原酸、咖啡酸、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C平均加樣回收率分別為99.0%、97.1%、100.5%、102.7%、98.1%、100.1%，RSD分別為2.62%、1.81%、2.68%、1.99%、2.45%、2.82%。

2.5.6 樣品含量測定 取12批樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表6。

3 討論

滇桂艾納香廣泛應用于治療經期提前、產后血崩等婦科疾病。根據課題組前期實驗發現，滇桂艾納香正丁醇部位藥理活性較強，是滇桂艾納香發揮凝血、止血作用的主要活性部位，采用HPLC法建立滇桂艾納香正丁醇部位指紋圖譜，并對其活性成分含量進行測定，為其質量評價及進一步開發提供依據。

3.1 色譜條件優化 在建立指紋圖譜實驗時考察了3種色譜柱Inertsil ODS3-C18(250 mm×4.6 mm)、TC-C18(250 mm×4.6 mm)，Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm)，結果表明 Zorbax SB-C18(150 mm×4.6 mm)峰形較其他色譜柱好，出峰時間較適宜。對不同吸收波長(260、300、330 nm)進行考察，對比得出260 nm得到較多的峰信息。對不同柱溫(25、30、35 ℃)進行考察時，得出35 ℃條件下峰形與分離度較好。對體積流量(0.8、1.0、1.2 mL/min)考察時，得出1.0 mL/min的條件下，峰形以及出峰時間適宜。對甲醇-0.2%磷酸與乙腈-0.2%磷酸為流動相進行考察時，發現乙腈-0.2%磷酸洗脫結果優于前者。

表6 各成分含量測定結果(mg/g，n=3)

3.2 供試品溶液制備方法優化 含量測定試驗考察了冷浸、超聲、回流3種提取方法, 結果表明回流與超聲得到的色譜圖基本無較大差異，因超聲提取方式較簡便，故選擇超聲作為提取方式；前期藥理學實驗結果表明，滇桂艾納香70%乙醇提取物有較強生理活性，故本文選用70%乙醇作為提取溶劑；對30、60、90 min提取時間進行考察，得出當提取時間為60 min時，各色譜峰峰面積較大，峰高較高，90 min與60 min峰響應值相差不大，為節省時間提取時間設定為60 min。

3.3 結果分析 本研究共指認出6種活性成分，因異綠原酸B的含量較高，在分析時間內出峰時間適合，故將異綠原酸B作為參照峰(S)。不同批次滇桂艾納香正丁醇部位指紋圖譜相似度均大于0.9，說明不同批次滇桂艾納香藥材化學成分種類較相似，含量測定研究結果顯示，不同批次滇桂艾納香藥材正丁醇活性部位6種活性成分含量有較大的差異，說明其化學成分含量存在較大差異。

4 結論

本研究建立不同批次滇桂艾納香正丁醇部位HPLC指紋圖譜，指認了指紋圖譜中6種成分，初步反映了滇桂艾納香正丁醇活性部位整體化學特征，檢測方法簡單可行，重復性、穩定性良好，同時結合化學計量學方法，采用聚類分析和主成分分析多方面評價滇桂艾納香正丁醇活性部位質量，為滇桂艾納香正丁醇活性部位整體質量控制提供參考。