貝母屬多糖分離、鑒定、生物活性研究進(jìn)展

趙宏權(quán)， 王知斌， 孫延平， 楊春娟， 楊炳友， 匡海學(xué)*

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，教育部北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江省中藥及天然藥物藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150081)

貝母屬植物在中國(guó)分布約80種，變種及變型約50多個(gè)[1]，2020年版《中國(guó)藥典》中貝母屬植物的入藥部位為干燥鱗莖，國(guó)內(nèi)植物資源主要分布于浙江、四川、黑龍江、新疆、甘肅、湖北、安徽等省[2]。在歷史進(jìn)展中多數(shù)貝母在藥用和食用方面不斷被開(kāi)發(fā)和應(yīng)用[3]。隨著對(duì)貝母藥用資源的研究深入，人們?cè)谪惸笇僦兴幹邪l(fā)現(xiàn)了生物堿、萜類(lèi)、皂苷、多糖、微量元素、嘧啶與嘌呤類(lèi)以及核苷類(lèi)成分。多糖廣泛存在于動(dòng)物、植物、真菌、微生物體中[4]，其中對(duì)人體生理功能有調(diào)節(jié)作用的特異性多糖[5]在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、抗病毒、降血脂[6]、抗衰老、抗?jié)儭⒔笛恰⒔笛⒖鼓猍7]、心腦血管系統(tǒng)疾病、抗炎、抗輻射[8]等方面發(fā)揮作用。另外，多糖作為重要的生物活性物質(zhì)在食品、動(dòng)物養(yǎng)殖[9]、美容、乳化[10]等領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景，具有比較高的開(kāi)發(fā)潛力和研究意義。本文通過(guò)對(duì)浙貝母、平貝母、伊貝母、湖北貝母、川貝母、甘肅貝母、瓦布貝母、太白貝母、暗紫貝母、梭砂貝母在多糖的分離、鑒定、生物活性方面進(jìn)行綜述，以期為貝母屬多糖的研究開(kāi)發(fā)及利用提供參考。

1 制備

1.1 提取

1.1.1 水提醇沉法 水提醇沉法是從植物中提取多糖的常用方法。用該法提取太白貝母多糖，采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)提取工藝，對(duì)料液比、提取時(shí)間和提取溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果顯示太白貝母多糖最優(yōu)工藝參數(shù)為料液比1∶16.3，提取溫度84.2 ℃，提取時(shí)間1.6 h，提取率1.267%[11]；用相同方法得出神農(nóng)貝母多糖提取工藝的最佳條件為料液比1∶50，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間4 h[12]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)浙貝母多糖最佳提取工藝，得出其工藝參數(shù)為料液比1∶50，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間2.5 h，平均提取率7.43%[13]；而用單因素和3因素3水平正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)不同貝母多糖的提取優(yōu)化熱水提取條件，其結(jié)果表明提取的有效順序?yàn)樘崛囟?原料液比>提取時(shí)間，工藝參數(shù)為料液比1∶30，提取溫度90 ℃，提取時(shí)間3 h[14]。水提醇沉法作為常用的提取方法有著安全，成本低，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在提取時(shí)間長(zhǎng)，純度較低等缺點(diǎn)。

1.1.2 酸堿提取法 在酸堿提取法的應(yīng)用上通過(guò)將伊貝母脫脂粉末用水、酸(檸檬酸)和堿(氫氧化鈉)進(jìn)行連續(xù)提取，并將殘留物進(jìn)行下一步提取，得到4種伊貝母粗多糖，分別為FPSP-C、FPSP-H、FPSP-CA、FPSP-A[15]。酸堿提取法在一定程度可以提高提取效率，得到更多的多糖，但同時(shí)要考慮多糖和酸、堿之間的適用性，以防酸、堿對(duì)多糖產(chǎn)生降解作用。

1.1.3 微波提取法 微波提取法是從天然植物、礦物或動(dòng)物組織中提取天然化合物及生物活性成分的方法，該法有著快速高效、加熱均勻、不易使成分分解、應(yīng)用面廣等優(yōu)點(diǎn)。甘孜川貝母在微波提取法的基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)，得出其多糖的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶30，提取溫度90 ℃，微波時(shí)間3 min，該提取法提高了貝母多糖的提取率[16]。

1.1.4 超聲提取法 超聲波提取在中藥材工藝方面的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛。在提取效率、時(shí)間、溫度等方面，超聲波提取與傳統(tǒng)提取方法相比有較大的優(yōu)勢(shì)。響應(yīng)面法設(shè)計(jì)太白貝母多糖提取工藝，得出最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶15，提取溫度75 ℃，超聲提取時(shí)間16 min，總糖含量0.46%[17]；而通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)太白貝母多糖提取工藝，同時(shí)考察水浴、超聲、煎煮法對(duì)其多糖含量影響，得出超聲波法工藝參數(shù)為料液比1∶15，提取溫度80 ℃，提取時(shí)間15 min，其效果明顯優(yōu)于其他2種方法[18]。

1.1.5 其他 在提取方法中，超聲提取法與酶提取法的聯(lián)用也有被使用，如分別采用超聲波輔助提取法(UA)、纖維素酶輔助提取法(CA)、纖維素酶-超聲輔助提取法(CUA)、果膠酶-超聲輔助提取法(PUA)對(duì)伊貝母多糖提取率進(jìn)行考察，結(jié)果表明，CUA法提取率最高為(20.65±0.78)%，其中碳水化合物(56.16±0.38)%、糖醛酸(28.34±0.23)%[19]。

1.2 分離純化 為獲得均勻的多糖，需要除去蛋白質(zhì)、色素，以及無(wú)機(jī)鹽、單糖、低聚糖、氨基酸和部分色素等小分子物質(zhì)[20]。其中蛋白質(zhì)雜質(zhì)對(duì)多糖的純度和生物活性有較大的影響[21]，傳統(tǒng)除蛋白質(zhì)的方法有Sevag試劑法、三氯乙酸法(TCA)、酶法等[22]，新型脫蛋白方法主要包括凍融法、雙醛纖維素法、磁性殼聚糖微球法、CaCl2法、樹(shù)脂吸附法和醋酸鉛法[23]。大量色素影響多糖的色譜分析和性質(zhì)測(cè)定，常用脫色方法有吸附法、氧化法、離子交換法、大孔吸附樹(shù)脂法等[24]。此外去除鞣質(zhì)色素一般使用活性炭吸附法以及分離脫色兼得的DEAE纖維素吸附法[22]。透析是除去小分子雜質(zhì)的有效手段[20]。

在分離純化過(guò)程中，一般會(huì)進(jìn)行脫脂前處理或根據(jù)需要去除生物堿、皂苷等成分。如石油醚及二氯甲烷對(duì)瓦布貝母(FUW)粗多糖進(jìn)行脫脂，S-8大孔樹(shù)脂脫色，蛋白酶、Sevag試劑脫蛋白，水透析以除去小分子物質(zhì)，Sepharose G-150凝膠過(guò)濾柱進(jìn)一步純化級(jí)分[25]。相同的是伊貝母粗多糖溶解在蒸餾水中，進(jìn)行相同的脫蛋白以及除小分子雜質(zhì)處理，不同的是利用α-淀粉酶除去淀粉，DEAE-52色譜柱、Sephadex G-100色譜柱進(jìn)一步分離，根據(jù)收集到的樣品的峰位，從而獲得純化的多糖級(jí)分[15]。通過(guò)對(duì)核酸、蛋白、色素脫除率以及多糖損失率和羥基自由基清除效果進(jìn)行純化效果考察分析，將太白貝母和甘孜川貝母多糖提取液經(jīng)過(guò)4種不同類(lèi)型樹(shù)脂靜態(tài)吸附純化，結(jié)果顯示，純化效果最佳的樹(shù)脂類(lèi)型排序?yàn)?01×4型樹(shù)脂>AB-8型樹(shù)脂>DA201-C型>HPD600型大孔樹(shù)脂[26]，而從4種不同預(yù)處理大孔樹(shù)脂對(duì)相同2種貝母純化效果來(lái)看，大孔樹(shù)脂需浸泡24 h以上且有必要進(jìn)行加酸堿處理，才能有較好的純化效果[27]，這可以看出進(jìn)行除雜的手段基本為傳統(tǒng)方法之間的聯(lián)用，進(jìn)一步純化則是采用柱色譜法，這在很大程度上提高了多糖的純度。具體信息見(jiàn)表1。

表1 貝母多糖分離純化表

2 結(jié)構(gòu)解析

多糖的分子量、單糖的連接順序以及空間構(gòu)象等決定了其生物功能活性[33]。近年來(lái)通過(guò)物理、化學(xué)、儀器分析、生物技術(shù)及酶學(xué)等方法，以及各方法之間的聯(lián)用技術(shù)讓人們對(duì)植物多糖的結(jié)構(gòu)有了較為深入的了解[34]。

對(duì)貝母屬中藥多糖結(jié)構(gòu)的解析方法有紫外吸收光譜法(UV)、高效液相色譜法(HPLC)、核磁共振波譜法(NMR)、紅外光譜法(IR)、質(zhì)譜法(MS)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)、掃描電子顯微鏡(SEM)、X 射線衍射法(XRD)、薄層色譜法(TLC)、高效凝膠滲透色譜法(HPGPC)、熱分析法(TA)和剛果紅染色法等。其中UV法可以提供多糖、糖醛酸以及蛋白質(zhì)的信息；HPGPC法、GC法可以提供多糖分子量信息；單糖組成信息可由酸水解、TLC法、HPLC法、GC-MS法分析提供；糖環(huán)類(lèi)型及構(gòu)型信息可由IR法、NMR法分析提供；SEM法可觀察物質(zhì)表面的微觀形貌；XRD法對(duì)多糖是否為晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析；熱分析法可對(duì)多糖的熱穩(wěn)性進(jìn)行判斷；剛果紅染色法、UV法的使用可以分析多糖的構(gòu)象；糖殘基類(lèi)型及糖苷鍵連接位點(diǎn)信息可由甲基化反應(yīng)與GC-MS法聯(lián)用分析提供[5]。

研究采用傅里葉紅外光譜(FTIR)法顯示關(guān)鍵的官能團(tuán)，SEM法、XRD法、剛果紅試驗(yàn)顯示伊貝母多糖的特征結(jié)構(gòu)[19]。IR法、HPLC法對(duì)平貝母水溶性多糖FUP-1結(jié)構(gòu)和單糖組成進(jìn)行初步分析[31]。也有研究通過(guò)比較多元醇乙酸酯和標(biāo)準(zhǔn)糖的保留時(shí)間確定伊貝母多糖的單糖組成，伊貝母多糖FPSP-N結(jié)構(gòu)經(jīng)FTIR光譜和GC表征結(jié)果表明分離的化合物為雜多糖[28]。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生HPLC法所測(cè)不同貝母樣品的單糖組成相同，但比例不同[14]。而從存在不易確定的熱化學(xué)和晶形結(jié)構(gòu)上得出熱穩(wěn)定性的差異可能是由于提取、純化方法和分子構(gòu)象、單糖組成、多糖級(jí)分結(jié)構(gòu)之間的差異引起的，伊貝母多糖XRD法顯示多糖既有結(jié)晶性也有非晶態(tài)性質(zhì)[15]。其中較為深入的研究是，瓦布貝母多糖FWPS1-1經(jīng)I2-KI與UV結(jié)合測(cè)定，結(jié)果表明其具有更多的分支和更長(zhǎng)的側(cè)鏈，偏酸水解可用于分析多糖的側(cè)鏈和主鏈的單糖組成，與主鏈相比，多糖的側(cè)鏈鍵通常更容易被酸水解[25]。根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道，貝母多糖研究多集中在伊貝母，其研究結(jié)果較為豐富，而除此之外的貝母多糖研究較為不足，已有信息表明其共同之處在構(gòu)型上多屬于α構(gòu)型吡喃糖。詳細(xì)的多糖信息特征見(jiàn)表2。

表2 貝母屬多糖結(jié)構(gòu)信息特征表

續(xù)表2

3 生物活性

3.1 抗氧化 現(xiàn)代研究中藥抗氧化的機(jī)制為①在細(xì)胞水平上可以從自由基、抗氧化酶活性、脂質(zhì)代謝產(chǎn)物、細(xì)胞器和細(xì)胞凋亡方面闡述抗氧化作用[36]；②在基因表達(dá)層面開(kāi)展研究論述如調(diào)節(jié)抗氧化酶基因的表達(dá)及抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA 表達(dá),從而增強(qiáng)抗氧化能力[37]；③研究信號(hào)通路可緩解氧化應(yīng)激損傷以及清除機(jī)體或細(xì)胞內(nèi)自由基，提高抗氧化酶活性或水平，增強(qiáng)機(jī)體或細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的抗性[38]。

太白貝母多糖(PFT)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PFT對(duì)清除DPPH自由基和ABTS自由基具有顯著的清除作用，并隨著提取物濃度的增加而加強(qiáng)，其抗氧化能力可能與提取物中其他成分(如生物堿)的協(xié)同作用有關(guān)[39]。而同樣的體外研究中瓦布貝母多糖(FWPS1-1)表現(xiàn)出弱的DPPH自由基清除活性和低FRAP能力，但具有高的ABTS自由基清除活性和Fe(Ⅱ)螯合能力以及DNA損傷保護(hù)活性，具有良好的抗氧化活性和DNA保護(hù)作用[25]。在體內(nèi)抗氧化研究中發(fā)現(xiàn)平貝母多糖(FUP-1)表現(xiàn)出較強(qiáng)的羥基、超氧陰離子和DPPH清除自由基的活性。可以大大減少丙二醛(MDA)的增加，更新血清中的超氧化物歧化酶(SOD)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)，提高小鼠肝臟中的抗氧化能力(T-AOC)，這表明FUP-1不僅通過(guò)自身的自由基清除活性發(fā)揮抗氧化作用，而且還通過(guò)增強(qiáng)宿主的酶促和非酶促抗氧化劑防御系統(tǒng)發(fā)揮作用[30]，可以看出貝母多糖在多方面發(fā)揮抗氧化作用。

此外還可以對(duì)多糖進(jìn)行修飾，改變其結(jié)構(gòu)和部分理化性質(zhì)，從而改善多糖的活性[40]。對(duì)平貝母多糖(FUP)進(jìn)行化學(xué)修飾，隨后對(duì)得到的多糖鐵配合物FUP-Fe進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該多糖鐵配合物對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子自由基、羥自由基有清除作用，并且均強(qiáng)于平貝母多糖，最大清除率分別為68.9%、57.3%、46.9%[41]。同樣的，對(duì)平貝母多糖進(jìn)行化學(xué)修飾，得到平貝母多糖鋅配合物FUP-Zn，為評(píng)價(jià)該配合物的抗氧化能力，對(duì)羥基自由基和超氧陰離子自由基清除能力展開(kāi)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)FUP和Zn的結(jié)合使FUP-Zn配合物的抗氧化活性大大增強(qiáng)，且不同取代度的FUP-Zn配合物的抗氧化活性與鋅的用量有很大關(guān)系[29]，可見(jiàn)多糖修飾對(duì)多糖活性產(chǎn)生了較大影響，為多糖活性研究提供了參考依據(jù)。

3.2 抗衰老 現(xiàn)代研究表明，衰老是由于基因功能紊亂、蛋白穩(wěn)態(tài)失調(diào)、營(yíng)養(yǎng)代謝信號(hào)發(fā)生改變、線粒體出現(xiàn)損傷和干細(xì)胞耗竭以及細(xì)胞與炎性衰老等原因造成的[42]。中藥抗衰老主要是在抗自由基、調(diào)節(jié)免疫功能、調(diào)節(jié)神經(jīng)-內(nèi)分泌功能及抗DNA損傷等方面發(fā)揮作用，其他如基因表達(dá)、端粒研究也為研究的一大熱點(diǎn)[43]。

目前藥理學(xué)方法是研究降低機(jī)體衰老的方法之一[44]，中藥多糖抗衰老機(jī)制研究多集中在建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[45]。MDA水平高低以及單胺氧化酶(MAO)活性是影響衰老的重要標(biāo)志，研究通過(guò)由D-半乳糖誘導(dǎo)小鼠建立亞急性衰老小鼠模型，發(fā)現(xiàn)平貝母多糖(FUP-1)能降低MDA水平以及腦組織MAO活性，同時(shí)該多糖也能提高肝臟中的T-AOC、GSH-Px、SOD活性，表明FUP-1有抗衰老作用，但其同時(shí)也指出FUP-1可能不是通過(guò)直接抑制MAO活性而抗衰老的，其抗衰老作用可能與其提高抗氧化酶活性和抗脂質(zhì)過(guò)氧化有關(guān)[46]。然而有研究認(rèn)為FUP-1通過(guò)提高GSH-Px的活性和降低MDA水平來(lái)保護(hù)細(xì)胞，從而發(fā)揮抗衰老作用[47]。另外研究表明中藥多糖成分抗衰老作用主要是通過(guò)增強(qiáng)抗氧化與機(jī)體免疫力、清除自由基、抑制衰老基因表達(dá)以及調(diào)控細(xì)胞周期[45]。

3.3 抗炎 具有抗炎作用的多糖主要是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞分泌的1種或多種炎癥介質(zhì)，平衡炎癥部位的促炎因子與抗炎因子的水平，影響炎癥發(fā)展過(guò)程的各個(gè)階段[7]。發(fā)揮作用途徑主要有丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸的調(diào)節(jié)功能、干擾花生四烯酸代謝、抑制炎性介質(zhì)、抗血栓生成等[48]。

白細(xì)胞滲出伴血管反應(yīng)是炎癥的重要標(biāo)志，因此抑制或阻斷白細(xì)胞向血管外組織的遷移是控制炎癥發(fā)生的重要手段。在小鼠腫脹模型中用蛋清和二甲苯誘導(dǎo)小鼠踝部和耳廓腫脹，施加不同濃度的湖北貝母多糖(CPFK)可以減輕蛋清和二甲苯致小鼠腫脹的程度，發(fā)現(xiàn)主要是抑制體內(nèi)炎性細(xì)胞因子分泌，維持體內(nèi)促炎因子和抗炎因子的動(dòng)態(tài)平衡。又通過(guò)HE染色，觀察肝、腎組織病理學(xué)變化，結(jié)果顯示CPFK可明顯降低脂多糖(LPS)引起的炎癥反應(yīng)，降低了炎性細(xì)胞因子表達(dá)，最后表明CPFK對(duì)小鼠炎癥有抗炎作用，在一定濃度范圍內(nèi)，多糖濃度越高，對(duì)炎癥的治療效果越明顯，且在一定條件下，CPFK可減輕炎性滲出和水腫，從而減輕急性炎癥時(shí)器官水腫和梗阻的病理改變[14]。

4 結(jié)論與展望

制備方面，酸堿提取法雖能提高多糖的提取率，但酸堿易使多糖降解及容器腐蝕，不利于工業(yè)生產(chǎn)；超聲提取法也可因提取時(shí)間長(zhǎng)而造成多糖糖鏈斷裂[49]；微波法則會(huì)因輻射時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，系統(tǒng)溫度升高使得溶劑大量損失[50]；超聲-酶法在使用中需考慮酶的專(zhuān)一性、價(jià)格等問(wèn)題；水提醇沉法有著設(shè)備方便、安全、溶劑便宜易回收等優(yōu)點(diǎn)。考慮安全、設(shè)備、經(jīng)濟(jì)、工業(yè)化生產(chǎn)等問(wèn)題，水提醇沉法仍是常用的提取方法。

在分離鑒定中，多采用Sevage法、大孔樹(shù)脂法、透析法等進(jìn)行除雜。柱層析法作為分離的有效手段，填料多為凝膠、離子交換型纖維素和離子交換凝膠，常用型號(hào)有葡聚糖凝膠、二乙氨基乙基纖維素、瓊脂糖凝膠等，填料所具離子交換和分子篩作用性質(zhì)對(duì)分離多糖具有較好的效果。現(xiàn)代波譜技術(shù)對(duì)解析多糖結(jié)構(gòu)有很大優(yōu)勢(shì)，其中氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在復(fù)雜糖類(lèi)物質(zhì)定性定量分析方面具有樣品選擇性好、分析速度快等特點(diǎn)，但樣品需要衍生化；液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)省去對(duì)樣品的衍生化處理，具備高準(zhǔn)確度和低檢出限的特點(diǎn)，用于多糖的組成分析、單糖及寡糖的定量與定性、寡糖及多糖的結(jié)構(gòu)解析等。化學(xué)方法如甲基化分析等存在樣品量多、操作繁瑣、分析時(shí)間長(zhǎng)，誤差較大等缺點(diǎn)，但在如復(fù)雜多糖的降解上有著獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。在多糖的結(jié)構(gòu)解析中，應(yīng)以現(xiàn)代波譜技術(shù)分析為主，經(jīng)典化學(xué)方法為輔的方式對(duì)多糖結(jié)構(gòu)展開(kāi)解析。

在貝母多糖結(jié)構(gòu)解析中如糖鏈的研究，多糖生物活性如抗病毒、降血糖、抗腫瘤等的探究上還存在不足。一方面要繼續(xù)優(yōu)化貝母多糖的制備工藝，深入探究構(gòu)效關(guān)系，探究如糖鏈構(gòu)像、結(jié)構(gòu)修飾中引入不同官能團(tuán)以及多糖組成、分子量等對(duì)生物活性的影響；另一方面在糖生物學(xué)研究中，展開(kāi)與中草藥相結(jié)合的糖藥物研究，既可以作為治療疾病的藥物，也可作為保健食品。研究這些以糖類(lèi)為基礎(chǔ)的藥物，可以擴(kuò)大貝母屬中藥多糖的應(yīng)用范圍，為制藥、臨床、工業(yè)生產(chǎn)等做好鋪墊。