瑞香素藥動學、毒理學、生物活性的研究進展

樊思越， 王文昊， 羅寧烽， 張?zhí)炫啵?王 珍， 高佩佩， 龍建綱

(西安交通大學，陜西 西安 710049)

瑞香素屬于苯并吡喃酮類化合物，又名7,8-二羥基香豆素、祖師麻甲素，是從中藥祖師麻中提取得到的一種生物活性單體，同時也是我國自主研發(fā)的天然藥物，臨床上具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜效果，同時也廣泛用于治療血栓閉塞性脈管炎、冠心病心絞痛、類風濕性關節(jié)炎等疾病[1]，主要通過抗炎、抗氧化、代謝調節(jié)、自噬調節(jié)等分子通路發(fā)揮作用。本文就瑞香素近年在藥動學、毒理學、生物活性方面的研究進展進行綜述。

1 理化性質

瑞香素分子式為C9H6O4，化學結構見圖1，室溫下呈灰白色粉末狀，無色無味，為脂溶性藥物，堿性條件可發(fā)生開環(huán)降解，中性或弱酸性條件下較穩(wěn)定。

圖1 瑞香素化學結構

瑞香素因具有苯并吡喃酮的結構而被歸為香豆素類化合物，其母核香豆素的結構如圖2所示。由于環(huán)上不同位置常含不同取代基，除簡單香豆素外，香豆素類化合物還包括呋喃香豆素、吡喃香豆素、其他香豆素，在自然界中分布范圍較廣，常以游離態(tài)或與糖類結合為苷的形式存在于瑞香科、豆科、傘形科等高等植物體內。以往研究及臨床應用顯示，香豆素類藥物具有抑菌、抑腫瘤、抗炎、抗氧化、抗水腫、增強免疫、保肝等生物活性[2-3]，其中瑞香素抗炎、抗氧化的生物活性尤為突出。

圖2 香豆素化學結構

2 藥動學

2.1 吸收 曲淑巖等[4]通過大鼠尾靜脈給藥(80 mg/kg)發(fā)現(xiàn)，血藥濃度-時間曲線符合二室開放性模型，t1/2=0.043 h，t1/2=0.347 h；家兔經(jīng)皮給藥后，血藥濃度-時間曲線符合二室開放性模型，t1/2(ka)=0.462 h，t1/2=0.975 h，t1/2=4.926 h。在中性或酸性條件下瑞香素較為穩(wěn)定，不易受腸道酶影響，但在弱堿性條件下其內酯結構可能發(fā)生開環(huán)降解。大鼠在體單向腸灌流模型進行的實驗顯示，在瑞香素質量濃度10～40 μg/mL范圍內,各小腸段的有效滲透系數(shù)Peff有上升趨勢，但隨藥物濃度升高無飽和現(xiàn)象，而空腸、結腸Peff有顯著性差異 (P<0.05)；瑞香素在小腸吸收較好, 而且無特殊的吸收窗[5]。瑞香素在大鼠腸道內可能主要以被動擴散的方式被吸收，同時也可能存在多藥耐藥相關蛋白2(multidrug resistance-associated protein2, MRP2)、乳腺癌耐藥蛋白(breast cancer resistance protein, BCPR)的外排。

2.2 分布 以80 mg/kg劑量對大鼠進行靜脈注射給藥，15 min后發(fā)現(xiàn)瑞香素體內分布廣泛，在肝臟、腎臟中濃度最高，肺、脾、血漿、腦中次之，其他器官中也可見少量分布，1 h后不同程度降低，灌胃給藥2 h后的分布與靜脈給藥相似[4]。值得注意的是，瑞香素能穿過血腦屏障，這為中樞神經(jīng)疾病的防治提供了可能。

2.3 代謝 體外溫孵實驗證明，全血、肝臟、腎臟都能程度不同地對瑞香素進行代謝，在小鼠體內代謝則主要在肝臟中進行[4,6]。體外代謝特征分析顯示，大鼠肝臟中最占優(yōu)勢的代謝途徑為磺酸化反應，其次為甲基化和葡糖醛酸化反應，在大鼠肝勻漿上清液中瑞香素7、8位上的羥基易發(fā)生上述代謝反應生成相應代謝產(chǎn)物，該過程可能受尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉移酶(UDP-ducuronosyltranskrase, UGT)、兒茶酚轉甲基酶(catechol-O-methyltransferase, COMT)、磺基轉移酶(sulfotransferase, ST)等催化[6]；在人類肝臟勻漿上清液中，上述3種代謝途徑仍為主要路徑，但其中瑞香素清除率最高的途徑為甲基化反應，而非磺酸化反應[7]。

2.4 排泄 在靜脈注射、灌胃給藥2種途徑中，瑞香素均主要通過腎臟排泄[4]。大鼠灌胃給藥后對其尿液進行檢測，約2 h后可發(fā)現(xiàn)瑞香素分子的存在，然后其排泄量先增后降，至24～48 h尿液中僅有少量，最終尿液中無法再檢測到，其總排泄量不高于最初給藥量的6%，其原因可能是該成分轉化為其代謝產(chǎn)物[8]。由此說明，瑞香素在大鼠體內消除迅速，24 h內原型藥物可基本代謝完全。

3 毒理學

采用最大劑量法(100 mg/kg)對小鼠灌胃給予瑞香素，進行急性毒性試驗，觀察其皮膚、眼睛、黏膜、呼吸、循環(huán)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)，結果連續(xù)14 d均未發(fā)生中毒跡象，表明該成分對小鼠的口服毒性最大劑量超過100 mg/kg，此質量濃度約為人體有效劑量的175倍[9]。另對50只小鼠腹腔注射瑞香素，測得其LD50為429 mg/kg。

瑞香素溶液對家兔皮膚或粘膜沒有刺激作用，皮膚無紅斑、浮腫，全身無致敏現(xiàn)象，顯微鏡下也未發(fā)現(xiàn)明顯炎癥或組織損傷，口腔黏膜形態(tài)完好，無其他口腔黏膜刺激反應。由此認為，該成分無致敏性[9]。

在臨床應用中，瑞香素也鮮見不良反應發(fā)生。對35例應用瑞香素麻醉患者進行身體檢查，發(fā)現(xiàn)谷丙酶、麝香草酚濁度、尿素氮均在正常范圍內，隨訪21例均未發(fā)生不良反應或后遺癥。因此，該成分在臨床上短期使用是安全的。

4 藥理作用

瑞香素除了在心血管疾病方面的臨床應用外，對脂肪肝、炎癥反應、腦缺血再灌注、腦功能[10]等也具有一定的改善效應，其主要作用機制包括擴張血管、調節(jié)炎性因子、抗氧化、調節(jié)糖脂代謝、調節(jié)細胞自噬、調節(jié)線粒體功能等。

4.1 擴張血管 多年來的臨床應用證實了瑞香素治療血栓閉塞性脈管炎、冠心病的可靠性，該成分能擴張冠狀動脈，通過舒張主動脈和外周動脈實現(xiàn)收縮壓、舒張壓降低，血管外周阻力減小[11]。用瑞香素處理實驗性2型糖尿病大鼠模型，發(fā)現(xiàn)該成分可明顯加快血流速度，微血管管徑均明顯增大[12]。

大部分香豆素類化合物可通過內皮依賴性及非內皮依賴性方式舒張血管，其中又以非內皮依賴性的機制為主。作為香豆素類化合物，瑞香素可能也同樣是以劑量依賴性的方式作用于血管平滑肌細胞，通過抑制其膜上鈣離子通道，包括電壓依賴的鈣離子通道(voltage-dependent calcium channels, VDCC)、受體操縱性鈣離子通道(receptor-operated calcium channels, ROCC)，達到阻止鈣離子跨膜進入細胞的目的，并可能阻斷鈣離子從肌質網(wǎng)中涌出而達到舒張血管的作用[13]。另外，開放鈣激活鉀離子通道和5-羥色胺受體的競爭拮抗作用也有可能是香豆素類藥物發(fā)揮血管舒張作用的部分原因[14]。

4.2 免疫調節(jié) 瑞香素可在諸多模型中降低白細胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)、白細胞介素-6(interleukin 6, IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α)等多種炎癥因子表達，涉及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)、核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factorkappa-light-chain-enhancer of activated B cells, NF-κB)等信號通路的調控，從而起到減輕炎癥反應的作用。在體外實驗中，有學者報道用瑞香素處理TNF-α誘導人永生角質形成細胞，發(fā)現(xiàn)該成分能顯著減弱該細胞中IL-1β、IL-6、TNF-α、白細胞介素-8(interleukin 8, IL-8)、單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1, MCP-1)等炎癥因子表達上調，表明它可有效減輕TNF-α誘導該模型產(chǎn)生的炎癥反應，而該過程可能涉及到NF-κB信號途徑[15]。Zhang等[16]研究瑞香素對骨關節(jié)炎的作用，發(fā)現(xiàn)該成分可抑制IL-1β誘導的兔軟骨細胞中IL-6、白細胞介素-12(interleukin 12, IL-12)、基質金屬蛋白酶-3(matrix metalloprotein 3, MMP-3)、基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloprotein 9, MMP-9)、基質金屬蛋白酶-13(matrix metalloprotein 13, MMP-13)表達，并能刺激白細胞介素-10(interleukin 10, IL-10)產(chǎn)生，它對MMP的抑制作用部分受到磷脂酰肌醇-3-激酶/絲蘇氨酸蛋白激酶(phosphatidyl-inositol 3-kinase/serine-threonine kinase, PI3K/Akt)信號通路、MAPK和NF-κB信號通路抑制性調節(jié)。Li等[17]發(fā)現(xiàn)，瑞香素對系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠也具有炎癥抑制作用，可通過上調A20蛋白表達來實現(xiàn)NF-κB通路下調，提高動物存活率，從而起到良好的抗炎效果。

Shen等[18]報道，瑞香素可抑制內毒素誘導的內毒素血癥小鼠的促炎因子產(chǎn)生，并能通過抑制脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)誘導激活的Janus激酶(janus kinase, JAK)/信號轉導子和轉錄活化子(signal transducer and activator of transcription, STAT)信號通路及活性氧(reactive oxygen species, ROS)產(chǎn)生而表現(xiàn)出抗炎特性。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)，瑞香素可降低大腦動脈阻塞和再灌注模型小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6過表達并抗細胞凋亡，降低Toll樣受體4(toll-like receptor 4, TLR4)表達、核因子κB抑制蛋白α(nuclear factor of kappa light polypeptide gene enhancer in B-cells inhibitor alpha, IκB-α)降解及NF-κB的核轉位，顯示了該成分在模型中良好的神經(jīng)保護作用及抗炎效果，其潛在分子機制可能涉及對TLR4/NF-κB介導炎性信號傳導通路的抑制。

除了對炎性因子的調節(jié)外，瑞香素也可以通過其他方式改善實驗模型免疫狀態(tài)。Wang等[20]報道，瑞香素能減輕實驗性自身免疫性腦脊髓炎臨床癥狀，顯著抑制Th1、Th17細胞反應，抑制DCs活化、成熟、抗原呈遞能力；促進膠原誘導關節(jié)炎大鼠的T淋巴細胞增殖，并能提高腫瘤殺傷力，促進大鼠免疫功能[21]。

4.3 抗氧化 瑞香素抗氧化效應與丙二醛(malondialdehyde, MDA)、谷胱甘肽(glutathione, GSH)及多種氧化相關酶類如髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性相關。在LPS、D-半乳糖苷誘導的急性肝衰竭過程中，瑞香素可通過抑制MDA形成來降低MPO水平，改善急性肝衰竭導致的SOD、GSH活性下降，緩解氧化應激對肝臟的損害[22]。劉志勇等[23]以瑞香素處理重癥急胰腺炎小鼠，發(fā)現(xiàn)MDA水平和MPO活性降低。在高葡萄糖誘導的人腎小球系膜細胞中，瑞香素預處理后能降低ROS、MDA水平，提高細胞中SOD活性，進而抑制高葡萄糖誘導的氧化應激[24]。

在氧化應激情況下，瑞香素作用機制可能與NF-E2相關因子2(nuclear erythroid 2-related factor 2, Nrf2)-Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1(kelch-like ECH-associated protein 1, Keap1)系統(tǒng)關系緊密。Lv等[25]研究瑞香素對砷誘導人肺上皮細胞毒性的保護效果及其分子機制，發(fā)現(xiàn)該成分以劑量依賴性方式誘促進Nrf2核轉位，降低Keap1蛋白表達，Nrf2與抗氧化元件結合，從而上調抗氧化酶表達；誘導AMP依賴的蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate (AMP)-activated protein kinase, AMPK)活化，c-Jun 氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)和胞外信號調節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)磷酸化，并能阻礙砷誘導的細胞活力下降和ROS產(chǎn)生，推測其對砷作用產(chǎn)生的細胞毒性和細胞凋亡可能與Nrf2依賴的抗氧化反應的誘導以及抗凋亡因子(B-cell lymphoma-2, Bcl-2)在人肺上皮細胞中的穩(wěn)定有關。Zhi等[26]發(fā)現(xiàn)，瑞香素能通過誘導Nrf2的核易位來誘導血紅素加氧酶-1(Heme oxygenase, HO-1)的表達和活性，減輕海馬神經(jīng)元缺血再灌注模型中的氧化應激及細胞損傷。

4.4 調節(jié)糖脂代謝 Liu等[27]在油酸誘導的HepG2細胞模型中發(fā)現(xiàn)，瑞香素干預后可降低固醇調節(jié)元件結合蛋白-1(sterol regulatory element-binding protein-1, SREBP-1)、馬鈴薯糖蛋白樣磷脂酶結構域蛋白(patatin-like phospholipase domain-containing protein 3，PNPLA3)的蛋白和mRNA表達，上調過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator activated receptor-α,PPARα)基因、AMPK磷酸化水平，從而抑制脂質在肝細胞中的積累；增強磷脂酰肌醇激酶PI3K蛋白表達，促進Akt磷酸化，從而促進肝細胞對葡萄糖的吸收和利用。在糖尿病的研究中，PPARs一直被認為是治療靶點，但已有靶向藥物具有肝毒性、體質量增加等嚴重不良反應，目前開發(fā)PPARs雙重激動劑，旨在改善代謝同時能盡量減小副作用。有研究表明，瑞香素質量濃度在40、80 μmol/L下可雙重激活PPAR-α/γ, 80 μmol/L下可使PPAR-α/β/γ表達得到激活[28-29]。此外，有學者發(fā)現(xiàn)瑞香素對鏈脲佐菌素(streptozotocin, STZ)誘導的大鼠胰島素瘤胰腺β細胞損傷具有抑制脂質過氧化的效果，并可改善該細胞胰島素分泌障礙，顯示出瑞香素具有抵抗糖尿病的潛力[30]。由此表明，瑞香素在調節(jié)糖脂代謝方面有重要臨床應用前景。

4.5 自噬調節(jié) Lv等[22]構建急性肝衰竭模型，發(fā)現(xiàn)由LPS及D-半乳糖苷誘導的小鼠急性肝衰竭會導致肝臟自噬因子Beclin-1、Agt16、Agt12、Agt7、Agt5、Agt3蛋白表達下降，并會降低LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比率，而瑞香素干預則能明顯地抑制上述自噬因子表達的下調，從而起到保護肝臟的作用。Zhang等[31]報道，瑞香素可促進金黃色葡萄球菌處理的巨噬細胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉化和LC3顆粒的形成，同時瑞香素抑制雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)及下游信號通路的激活，抑制轉錄因子EB(transcription factor EB,TFEB)，從而觸發(fā)溶酶體基因的表達。

除此之外，瑞香素也可在自噬激活模型中發(fā)揮抑制作用。Deng等[32]以TNF-α誘導膠原蛋白誘導性關節(jié)炎大鼠的成纖維樣滑膜細胞，發(fā)現(xiàn)瑞香素可減弱TNF-α誘導所致Atg5、Beclin-1、LC3蛋白表達上調，并通過抑制Akt和mTOR活化、下調PKB信號通路激活，從而抑制關節(jié)炎大鼠成纖維樣滑膜細胞自噬，減少細胞中受TNF-α刺激增加自噬體。

4.6 線粒體相關調節(jié) 瑞香素通過促進JNK、ERK的磷酸化激活來使得Nrf2與Keap1之間實現(xiàn)有效分離，然后Nrf2蛋白進一步啟動下游啟動子轉錄，從而誘導包含谷氨酸-半胱氨酸連接酶催化亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit, GCLC)、谷氨酸-半胱氨酸連接酶修飾亞基(glutamate-cysteine ligase modifier subunit, GCLM)、HO-1在內的一系列抗氧化酶表達，有效改善線粒體功能障礙，表現(xiàn)為抑制ROS對線粒體的氧化損害，從而抑制炎癥應答及細胞凋亡[33]。由此表明，瑞香素可能有助于線粒體損傷相關疾病的防治。

5 展望

目前，瑞香素已作為臨床治療脈管炎、冠心病等疾病的藥物，可通過免疫調節(jié)、糖脂代謝調節(jié)、自噬調節(jié)等多種分子通路發(fā)揮生物學活性。進一步探索該成分作用機制對相關疾病防治具有重要意義。例如，阿爾茲海默癥不僅是中樞神經(jīng)病理變化系統(tǒng)疾病，其早期還會伴隨中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)的慢性炎癥、氧化應激，表現(xiàn)出線粒體功能障礙、代謝紊亂等病理癥狀，而瑞香素的多重藥理效應和分子通路有望為該疾病防治提供新的研究思路及解決方案。