無花果粗多糖脫色工藝優化及其吸附性能研究

曾 杰， 房海靈*， 梁呈元*， 亓希武， 郭 強

(1.江蘇省中國科學院植物研究所，江蘇 南京 210014；2.句容市虎耳山無花果專業合作社，江蘇 鎮江 212013)

無花果FicuscaricaL.為?？崎艑俣嗄晟淙~灌木，因花隱藏于花托內，只見果不見花而得名[1]，是人類最早馴化栽培的果樹之一，具有抗氧化、抑菌、抗癌、降血糖血脂功效，可治療胃癌、表皮癌、肝癌、糖尿病、高血脂癥等，是一種極具開發潛力的藥食同源型水果[2-4]，多糖是其主要活性成分之一[5]。目前，常用的多糖提取方法為水提醇沉法，但含有色素、蛋白質等雜質，嚴重影響了其功效[6]。為了更好地對無花果多糖進行開發應用，有必要尋找一種適合的純化方法對其進行脫色。

目前，常用的多糖脫色方法有活性炭法、過氧化氫法、大孔樹脂吸附法，其中活性炭法耗時長，活性炭難以去除[7]；過氧化氫法氧化強度過高，會導致多糖結構破壞[8]；大孔樹脂吸附法利用樹脂與被吸附分子之間范德華引力的強弱而達到多糖純化目的，具有操作簡便、吸附效果好、不改變多糖性質等優點，被廣泛應用于多糖脫色工藝[9]。因此，本實驗在篩選大孔樹脂類型的基礎上，采用單因素試驗結合響應面法優化影響無花果粗多糖中色素吸附效果的因素，并考察樹脂解吸附性質，分析其再生功能，以期為該成分的進一步開發利用提供技術支撐。

1 材料

1.1 藥材 無花果為采自句容市虎耳山無花果專業合作社的“瑪斯義陶芬”成熟果實，經江蘇省中國科學院植物研究所劉啟新研究員鑒定為桑科榕屬植物無花果FicuscaricaL.的果實，洗凈自然晾干后切成0.5 cm厚片，-50 ℃真空冷凍干燥機中干燥，粉碎后過40目篩備用。

1.2 試劑與藥物 D941、XDA-1、AB-8、D3520、D301型大孔吸附樹脂(北京中冉旭升科技發展有限公司)。硫酸、苯酚、乙醇等均為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)。

1.3 儀器 Lab-1A-50E真空冷凍干燥機(北京博醫康實驗儀器有限公司)；SpectraMax Plus 384連續光譜掃描式酶標儀(美國Molecular Devices公司)；Rotavapor R-210旋轉蒸發儀(瑞士Buchi Labortechnik AG公司)。

2 方法

2.1 粗多糖制備 藥材粉末按料液比1∶60加水混勻，70 ℃下超聲提取25 min，濾過，棄濾渣，濾液低溫濃縮至原體積的1/4，加4倍量95%乙醇靜置過夜，4 500 r/min離心15 min，用適量無水乙醇清洗沉淀2次，-50 ℃下冷凍干燥，即得。

2.2 大孔吸附樹脂篩選 取冷凍干燥后粗多糖，精密稱定質量后，加去離子水溶解，搖勻，制得質量濃度為5 mg/mL的溶液。精密稱取經預處理的5種大孔吸附樹脂各4 g，置于100 mL具塞三角瓶中，加入50 mL上述溶液，調節pH至6.4，30 ℃恒溫搖床中150 r/min勻速振蕩120 min，4 000 r/min離心10 min，收集上清液，測定脫色率、多糖保留率，其中多糖含量采用苯酚-硫酸法測定[9]，保留率Y1計算公式為Y1=(C2/C1)×100%(C1、C2分別為脫色前、脫色后多糖含量)。將樣品于300～650 nm波長范圍內完成掃描，發現吸收峰在450 nm左右，故選擇其作為檢測波長，同時對不同pH粗多糖溶液進行掃描，發現pH僅對吸光度有影響，而對最大吸收波長幾乎無影響，脫色率Y2計算公式為Y2=[(A1-A2)/A1]×100%[9](A1、A2分別為脫色前、脫色后溶液吸光度)。綜合指標=(多糖脫色率+多糖保留率)/2。

2.3 靜態吸附動力學研究 精密稱取大孔吸附樹脂4 g至100 mL具塞三角瓶中，加入50 mL“2.2”項下粗多糖溶液，調節pH至6.4，在30 ℃恒溫搖床中150 r/min勻速振蕩，每隔一定時間取樣，測定多糖保留率和脫色率，繪制吸附動力學曲線。

2.4 靜態吸附參數優化

2.4.1 單因素試驗 (1)在粗多糖溶液質量濃度(上樣質量濃度)5 mg/mL、pH 6.4、脫色時間2 h，脫色溫度30 ℃的條件下，設定樹脂用量分別為2、4、6、8、10、12 g/mL；(2)在樹脂用量4 g/mL、pH 6.4、脫色時間2 h、脫色溫度30 ℃的條件下，設定上樣質量濃度分別為2.5、5、10、15、20、25、30 mg/mL；(3)在樹脂用量4 g/mL、上樣質量濃度5 mg/mL、脫色時間2 h、脫色溫度30 ℃的條件下，設定pH分別為3、4、5、6、7、8；(4)在樹脂用量4 g/mL、上樣質量濃度5 mg/mL、pH 6.4、脫色溫度30 ℃的條件下，設定脫色時間分別為1、2、3、4、5、6 h；(5)在樹脂用量4 g/mL、上樣質量濃度5 mg/mL、pH 6.4、脫色時間2 h的條件下，設定脫色溫度分別為10、20、30、40、50、60 ℃。

2.4.2 響應面法 在單因素試驗基礎上，通過Design-Expert 8.0.6軟件進行響應面設計，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4.3 靜態解吸附實驗 稱取相同質量樹脂6份，置于三角瓶中，加入相同體積和質量濃度的粗多糖溶液，在pH 4.2、吸附溫度32 ℃的條件下恒溫振蕩5 h至吸附平衡，濾過，超純水清洗樹脂后吸干水分，加入相同體積0、20%、40%、60%、80%、95%乙醇，恒溫下振蕩10 h，測定多糖、色素含量，計算解吸率[10]。

2.5 統計學分析 通過Design expert 8.0.6、GraphPad Prism v6.02軟件進行處理。

3 結果

3.1 大孔吸附樹脂篩選 大孔吸附樹脂的吸附性能受樹脂組成、極性、空間結構(孔徑、比表面積)、被吸附分子極性和大小等因素影響[11]，故選擇適宜樹脂對無花果粗多糖脫色至關重要。表2顯示，D301型樹脂對無花果粗多糖的脫色效果及多糖保留率優于其他樹脂，這是因為無花果粗多糖中色素大多為具有酚羥基的化合物，生成氫鍵的能力較強，易于與D941、AB-8、D301等弱極性樹脂產生較強的吸附作用；XDA-1、D3520等非極性樹脂則對色素吸附能力較低；較高比表面積也有利于樹脂吸附，3種弱極性樹脂中以D301樹脂的比表面積相對較大，色素吸附量也更高。因此，本實驗選擇D301樹脂用于無花果粗多糖的色素去除。

表2 5種大孔吸附樹脂對粗多糖色素的吸附效果

3.2 靜態吸附動力學 圖1顯示，吸附時間在0～100 min時，脫色率隨著時間延長而呈快速升高的趨勢，表明色素吸附量迅速增加；在100～125 min時，色素吸附量呈緩慢上升階段；125 min后D301樹脂對色素的吸附、解吸附達到動態平衡。因此，選擇125 min作為最優吸附時間。

圖1 D301樹脂靜態吸附動力學曲線(n=3)

3.3 靜態吸附參數

3.3.1 樹脂用量對粗多糖脫色效果的影響 圖2顯示，樹脂用量為2 g時，由于色素、多糖含量超出樹脂吸附能力，故仍存在多余的兩者未被吸附，導致脫色率低、多糖保留率高；隨著樹脂用量增加，色素脫除率先升高后保持穩定，而多糖保留率降低，其原因可能是隨著樹脂量升高，其吸附量大于擴散出來的色素分子，脫色率達到飽和，同時被樹脂吸附的多糖也隨之增加。因此，選擇4 g/50 mL作為樹脂用量進行后續優化。

注：不同小寫字母表示同一參數在不同因素水平有差異，P<0.05。圖2 樹脂用量對粗多糖脫色效果的影響(n=3)

3.3.2 上樣質量濃度對粗多糖脫色效果的影響 圖3顯示，上樣質量濃度為5～35 mg/mL時，脫色率急劇降低，保留率則變化不顯著。因此，選擇5 mg/mL作為上樣質量濃度進行后續優化。

注：不同小寫字母表示同一參數在不同因素水平有差異，P<0.05。圖3 上樣質量濃度對粗多糖脫色效果的影響(n=3)

3.3.3 pH對粗多糖脫色效果的影響 圖4顯示，隨著pH的升高，脫色率先升高后降低，在3～5時最高；保留率亦然，在4時最高。因此，選擇pH 4進行后續優化。

注：不同小寫字母表示同一參數在不同因素水平有差異，P<0.05。圖4 pH對粗多糖脫色效果的影響(n=3)

3.3.4 脫色時間對粗多糖脫色效果的影響 圖5顯示，隨著脫色時間延長，脫色率先升高后趨于平緩，在2～3 h時最高，保留率則先升高后降低。因此，選擇2 h作為脫色時間進行后續優化。

注：不同小寫字母表示同一參數在不同因素水平有差異，P<0.05。圖5 脫色時間對粗多糖脫色效果的影響(n=3)

3.3.5 脫色溫度對粗多糖脫色效果的影響 圖6顯示，隨著溫度升高，脫色率先升高后降低，在30 ℃時最高；大于30 ℃后，樹脂對色素的解析速度大于吸附速度，導致脫色率大幅降低，同時多糖分子易發生結構變化，使得保留率也降低。因此，選擇30 ℃作為脫色溫度進行后續優化。

注：不同小寫字母表示同一參數在不同因素水平有差異，P<0.05。圖6 脫色溫度對粗多糖脫色效果的影響(n=3)

3.3.6 響應面法 在單因素試驗基礎上，選擇pH(A)、上樣質量濃度(B)、脫色時間(C)、脫色溫度(D)作為影響因素，脫色率作為評價指標(Y)，通過Design expert 8.0.6軟件進行響應面設計，結果見表3。

對表3數據進行多元回歸分析，得方程為Y=85.74+2.30A+1.17B+0.13C-4.78D+0.47AB+0.50AC+0.23AD-0.18BC+0.55BD+0.42CD-5.25A2-2.16B2-1.74C2-10.22D2，方差分析見表4。由此可知，模型P<0.01，表明其極顯著；失擬項P>0.05，表明模型成功建立；模型R2=0.987 8，表明其擬合程度較好；A、B、C、A2、B2、C2、D2有顯著影響(P<0.05)。最終確定，最優脫色工藝為pH 4.23，脫色溫度32.2 ℃，樹脂用量4 g/50 mL，上樣質量濃度5.52 mg/mL，脫色時間2.03 h，脫色率86.69%。

表3 試驗設計與結果

響應面分析見圖7。由此可知，與因素B方向比較，A效應面曲線較陡，表明pH對脫色率的影響高于上樣質量濃度：與C方向比較，A效應面曲線較陡，表明pH對脫色率的影響高于脫色時間；與A方向比較，D效應曲線較陡，等高線密度高于沿pH移動的密度，表明脫色溫度對脫色率的影響高于pH；與C方向比較，B效應面曲線略陡，表明上樣質量濃度對脫色率的影響高于脫色時間；與B方向比較，D效應曲線較陡，等高線密度高于沿上樣濃度移動的密度，表明脫色溫度對脫色率的影響高于上樣質量濃度；與C方向比較，D效應曲線較陡，等高線密度高于沿上樣濃度移動的密度，表明脫色溫度對脫色率的影響高于脫色時間。綜上所述，各因素影響程度依次為D>A>B>C。

3.4 驗證試驗 考慮到實際可操作性，將“2.3.6”項下優化工藝略作修改，即pH 4.2，脫色溫度32 ℃，樹脂用量4 g/50 mL，上樣質量濃度5.5 mg/mL，脫色時間2 h，并進行驗證試驗。結果，脫除率為86.18%，與預測值86.69%僅相差0.59%，并且多糖保留率為88.41%，表明模型擬合度良好。

表4 方差分析

3.5 樹脂解吸附及再生 樹脂通過范德華引力與物質吸附，相反地，改變樹脂與被吸附物質之間的吸附力可使被吸附物質脫附，進而實現樹脂再生和重復利用[10]，目前常用洗脫劑有甲醇、乙醇、丙酮等，從食品安全角度出發，本實驗選擇了乙醇，并考察其對D301樹脂再生效果的影響，結果見圖8。由此可知，隨著乙醇體積分數增加，樹脂對色素、多糖的解吸能力逐漸加強，在40%時解吸率達60%以上，在60%～95%時大大減弱了兩者與樹脂之間的引力，使其從中釋放出來，解吸率均在90%以上。從節約成本角度考慮，以60%乙醇為解吸液即可實現樹脂再生和循環利用。

圖7 各因素響應面圖

注：不同小寫字母表示同一參數在不同乙醇體積分數處理時有差異，即P<0.05。圖8 不同體積分數乙醇對D301樹脂解吸附性能影響

4 討論

不同類型大孔吸附樹脂因組成、空間結構、被吸附分子性質的不同，吸附效果也有所差異，例如菊苣多糖選擇D301G型樹脂脫色效果最好[12]，而草莓多糖以NKA-9型樹脂脫色效果最佳[13]。無花果粗多糖色素大多為具有酚羥基成分，生成氫鍵能力較強，易于與弱極性樹脂結合，故選擇弱極性D301樹脂進行吸附。

樹脂用量、上樣液質量濃度的篩選可最大程度利用樹脂吸附能力，有利于生產成本節約。本實驗樹脂用量起初過低，導致色素和多糖分子超出樹脂吸附能力；隨著其用量升高，吸附量大于擴散出的色素分子，脫色率達到飽和，同時被吸附的多糖分子也增加，表現為脫色率高、多糖保留率低。另外，上樣液質量濃度可通過影響多糖黏度來改變多糖和色素分子的擴散能力，另外還決定了大孔樹脂功能基團結合的兩者數目，其質量濃度過低雖然有利于色素吸附，但同時樹脂剩余功能基團會對多糖分子進行吸附，造成該成分損失。

pH可通過影響多糖和色素分子的結構來影響其與樹脂的吸附能力。本實驗發現，pH在3～5時D301樹脂對脫色效果最佳，可能是無花果粗多糖色素在弱酸性條件下表現為弱極性或非極性，易于被弱極性樹脂D301吸附；在堿性環境下，部分色素分子性質發生改變或多糖中部分還原糖發生美拉德反應，導致顏色加深、脫色率降低。

色素分子的擴散與被吸附需要一定的時間。本研究發現，吸附時間1 h時脫色率僅為73%，而延長至2 h時可達84%，可能是短時間內色素分子未被充分吸附，而達到一定時間后樹脂對色素的吸附和解吸達到平衡，但繼續延長后變化不大；多糖分子因時間延長出現死吸附現象，導致保留率略有下降。

溫度可通過改變多糖和色素分子擴散能力、樹脂吸附位點來影響吸附效果，劉海霞等[14]報道，20 ℃下LSA-800B樹脂對大棗多糖色素的吸附效果最佳。本實驗發現，30 ℃時D301樹脂對脫色效果最好，這是因為溫度過高加速了分子擴散能力，促進了色素分子與樹脂的吸附，但樹脂對色素的吸附是放熱過程，溫度過高會導致色素解吸速度大于吸附速度，進而引起脫色率大幅降低[15]。

響應面法利用多元二次方程擬合因素與響應值之間的函數關系來求取最優工藝參數，考察因素范圍全面，所得工藝參數可靠。本實驗結合單因素試驗和該方優化D301樹脂對無花果粗多糖色素脫除的影響因素，發現優化工藝下脫色率為86.18%，與預測值相對誤差較小，驗證了其可靠性和準確性。