蒜酶對同型半胱氨酸的催化裂解作用

哈米旦木·艾合買提江， 張婷婷， 任 銳， 敬 爽， 擺富葉， 李新霞，2*， 王 艷，2*

(1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆天然藥物活性組分與釋藥技術重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830011)

同型半胱氨酸(Hcy)又稱為高半胱氨酸，是體內蛋氨酸和半胱氨酸代謝的中間產物[1]，它是含硫氨基酸，血漿中存在2種形式，一種是還原型([H]-Hcy)，結構中含有巰基；另一種是氧化型([O]-Hcy)，其結構是還原型以二硫鍵所形成的，當血漿中其水平高于15 μmol/L時，即可診斷為高同型半胱氨酸血癥[2]。研究表明，高水平Hcy能夠通過各種途徑直接或間接的造成血管內皮細胞損傷，增強血小板功能活性，促使血栓形成，影響低密度脂蛋白的氧化過程，誘導和促進血管平滑肌細胞增殖[3]，現已被公認為是心腦血管疾病的獨立危險因素之一[4-5]，并尋找降低體內其水平的潛在藥物對心血管系統疾病的診斷與防治具有重要意義。

大蒜及其制品在醫藥和保健品方面已得到普遍認可，具有降血脂、預防動脈粥樣硬化、抗血小板聚集等多種藥理作用[6-8]，在防治高同型半胱氨酸血癥并冠心病、腦梗死等方面的臨床及實驗研究已有報道[9-10]。蒜酶又稱蒜氨酸裂解酶，是二聚體糖蛋白[11]，也是存在于大蒜中的內源酶，能裂解蒜氨酸C-S鍵，生成大蒜辣素和系列含硫化合物，從而表現出大蒜特性[11]，其適宜底物為S-烷基-L-半胱氨酸亞砜類化合物，Hcy結構與蒜酶的天然底物蒜氨酸結構相似，后者是否可通過催化裂解作用來降低前者水平值得探討。本實驗通過測定Hcy減少量，來探索蒜酶對其催化裂解作用。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀(型號LC-20AD-SPD-RID，日本島津公司)；紫外分光光度計(型號UV-2550，日本島津公司)；低溫高速離心機(型號MULTIFUGE X3R，美國賽默飛世爾公司)；分析天平(型號AB153-S，瑞士Mettler-Toledo公司)。

1.2 試劑與藥物 [H]-Hcy(純度≥98%，美國 Sigma Aldrich公司)；[O]-Hcy(純度≥90%，上海源葉生物科技有限公司)；三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；7-氟苯呋咱-4-硫酸銨鹽(SBD-F)(美國Sigma Aldrich公司)。蒜酶(新疆埃樂欣藥業有限公司，批號201801001)。甲醇為色譜純；磷酸二氫鈉、無水磷酸氫二鈉、鹽酸、氫氧化鈉、四硼酸鈉、乙二胺四乙酰二鈉、三氟乙酸、冰乙酸、結晶乙酸鈉均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液制備

2.1.1 [H]-Hcy對照品溶液 精密稱取[H]-Hcy對照品15 mg，置于50 mL量瓶中，磷酸鹽緩沖液溶解定容，即得(濃度為2 000 μmol/L)，使用時用磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度。

2.1.2 [O]-Hcy試劑溶液 精密稱取[O]-Hcy 27 mg，置于100 mL量瓶中，磷酸鹽緩沖液溶解，即得(濃度為1 000 μmol/L)。

2.1.3 蒜酶溶液 精密稱取蒜酶適量，置于量瓶中，pH 7.0磷酸鹽緩沖液渦旋溶解，搖勻，即得。

2.2 [O]-Hcy還原反應條件篩選 參考文獻[12-13]報道，固定還原溫度、還原時間分別為37 ℃、10 min。

2.2.1 吸收波長 精密量取[H]-Hcy對照品溶液2 mL，置于10 mL量瓶中，加pH 5.5磷酸鹽定容，在200～800 nm波長范圍內進行紫外光譜掃描。結果，Hcy在206 nm處有最大吸收，但該處屬于末端吸收，故確定210 nm作為檢測波長。

2.2.2 色譜條件 XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相0.04%三氟乙酸；體積流量0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長210 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖1。

注：A為[H]-Hcy，B為[O]-Hcy還原后。圖1 [O]-Hcy還原后HPLC色譜圖

2.2.3 還原劑用量 取10 mmol/L[O]-Hcy溶液2 mL，分別加入比例為1∶1、1∶2、1∶4、1∶8、1∶12的100 mmol/L TCEP還原劑，37 ℃水浴反應10 min，反應液過0.22 μm微孔濾膜，在“2.2.2”項色譜條件下進樣測定。結果，[H]-Hcy峰面積隨著還原劑劑量與[O]-Hcy比例增加升高，達到1∶8后不再變化，故確定兩者比例為1∶8。

2.3 [H]-Hcy衍生化反應條件選擇

2.3.1 檢測波長 精密量取1 mmol/L[H]-Hcy 1 mL，加不同比例SBD-F溶液，70 ℃水浴反應60 min后立刻放入冰水浴中冷卻10 min，定容至10 mL，掃描紫外吸收光譜，發現最大吸收波長為384 nm。

2.3.2 色譜條件 XBridge C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相pH 4.5醋酸鹽緩沖液(A)-甲醇(B)，梯度洗脫(0～16 min，2%～5%B)；體積流量0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測波長384 nm；進樣量20 μL。色譜圖見圖2。

注：A為[H]-Hcy衍生化后，B為[O]-Hcy衍生化后。圖2 [H]-Hcy、[O]-Hcy衍生化后HPLC色譜圖

2.3.3 衍生劑用量 取0.2 mmol/L[H]-Hcy 1 mL，分別加入比例為1∶1、1∶2、1∶4、1∶6的SBD-F衍生化溶液，70 ℃水浴反應60 min后冷卻10 min，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定。結果，當[H]-Hcy與SBD-F比例為1∶2時衍生化反應可達到完全，故確定兩者比例為1∶2。

2.4 方法學考察

2.4.1 線性關系考察 將[H]-Hcy對照品用磷酸鹽緩沖液溶解，搖勻定容，得320 μmol/L 貯備液，磷酸鹽緩沖液稀釋至10、20、40、80、160 μmol/L，分別量取適量，加入SBD-F工作液，70 ℃水浴反應60 min后冷卻10 min，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定。以衍生化[H]-Hcy濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行測定，得方程為Y=6 034.9X-73 769(r=0.999 0)，在10～160 μmol/L范圍內線性關系良好。同時，檢測限為10 μmol/L。

2.4.2 精密度試驗 制備[H]-Hcy對照品溶液，同一天在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定5次，計算日內精密度；連續測定5 d，計算日間精密度，測得兩者RSD分別為0.59%、0.83%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 重復性試驗 制備6份[H]-Hcy對照品溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD為0.9%，表明該方法重復性良好。

2.4.4 穩定性試驗 取[H]-Hcy對照品溶液適量，于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，測得峰面積RSD為1.39%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗 取低、中、高濃度標準溶液各3份，加樣后在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表1。

表1 [H]-Hcy加樣回收率試驗結果(n=3)

2.5 蒜酶對Hcy的催化裂解作用 分別取1 mmol/L[O]-Hcy溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL，加入蒜酶溶液0.4 mL，35 ℃水浴反應10 min，分別加入TCEP溶液0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mL，37 ℃水浴反應10 min，分別加入SBD-F貯備液0.12、0.24、0.36、0.48、0.60、0.72 mL，70 ℃水浴反應60 min后冷卻10 min，作為供試品溶液；另以磷酸鹽緩沖液替代蒜酶溶液加入反應體系，作為空白對照溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，結果見表2。由此可知，蒜酶可使[H]-Hcy含量在反應后有所降低，即對后者有一定的催化裂解作用。

表2 蒜酶對[O]-Hcy溶液中Hcy的催化裂解作用(n=3)

取大鼠血漿90 μL，置于EP管中，加入[O]-Hcy 10 μL、0.6 mol/L高氯酸100 μL，14 000 r/min離心10 min，吸取上清液100 μL，加入蒜酶400 μL，35 ℃水浴反應10 min，加入TCEP溶液30 μL，37 ℃水浴反應10 min，加入SBD-F貯備液430 μL，70 ℃水浴反應60 min后冷卻10 min，作為供試品溶液；另以磷酸鹽緩沖液代替蒜酶溶液加入反應體系，作為空白對照溶液，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，結果見表3。由此可知，蒜酶也可催化裂解大鼠血漿中的[O]-Hcy，轉化率可達到50%。

2.6 蒜酶/Hcy催化動力學研究

2.6.1 反應時間對酶促反應的影響 精密量取蒜酶溶液0.4 mL，精密加入1 000 μmol/L[O]-Hcy溶液0.1 mL，35 ℃水浴反應5、10、15 min，按“2.5.1”項下方法處理，微孔濾膜過濾，取20 μL，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算[H]-Hcy含量，結果見表4。由此可知，隨著反應時間延長，轉化率無明顯變化，故選擇反應時間為10 min。

表3 蒜酶對大鼠血漿中Hcy的催化裂解作用(n=3)

表4 反應時間對酶促反應的影響(n=3)

2.6.2 [O]-Hcy與蒜酶比例對轉化率的影響 精密量取[O]-Hcy 0.1 mL、不同濃度蒜酶溶液0.4 mL，35 ℃水浴反應10 min，按“2.5.1”項下方法處理，微孔濾膜過濾，取20 μL，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算[H]-Hcy含量，結果見表5。由此可知，[O]-Hcy與蒜酶比例為1∶6.0(即6.0 U蒜酶可催化裂解1 μg[O]-Hcy)時，轉化率可達到80%以上。

表5 [O]-Hcy與蒜酶比例對轉化率的影響(n=3)

2.6.3 底物濃度對酶促反應初速度的影響 精密量取蒜酶溶液0.4 mL，精密加入不同濃度[O]-Hcy溶液各0.1 mL，35 ℃水浴反應10 min，按“2.5.1”項下方法處理，微孔濾膜過濾，取20 μL，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定；另取[H]-Hcy對照品溶液，同法處理，在“2.3.2”項色譜條件下進樣測定，計算含量，測定反應速度，以反應速度V對相應底物濃度作圖，在直線范圍內作趨勢線，其斜率即為酶促反應的初速度(V0)，結果見圖3～4。由此可知，當磷酸鹽緩沖液pH為5.5時，在0～129.25 μmol/L范圍內V0為0.09 μmol/(L·min)；pH為5.5時，在0～64.78 μmo/L范圍內V0也為0.09 μmol/(L·min)。

圖3 底物濃度對酶促反應速度的影響(pH 5.5)

圖4 底物濃度對酶促反應速度的影響(pH 6.8)

2.6.4 動力學常數測定 以反應速度倒數為縱坐標(Y)，[H]-Hcy濃度倒數為橫坐標(X)，采用雙倒數作圖法作圖。結果，當磷酸鹽緩沖液pH為5.5時，Km為4 710 μmol/L，Vmax為384.62 μmol/(L·min)，回歸方程為Y=12.248X-0.002 6 (r=0.999 7)；pH為6.8時，Km為316.78 μmol/L，Vmax為22.03 μmol/(L·min)，回歸方程為Y=14.382X-0.045 4 (r=0.999 4)。

3 討論

研究蒜酶對Hcy催化裂解作用的前提是建立準確、可靠和簡便的檢測方法，目前有氣相色譜質譜聯用法、化學發光免疫法、HPLC法等[14-16]，其中最常用的是HPLC法。由于血漿中Hcy的存在形式有氧化型、還原型及其蛋白結合物等，故其HPLC法測定的都是總Hcy，首先加入還原劑使[O]-Hcy都轉換成[H]-Hcy，然后用巰基衍生劑進行柱前衍生化，最后采用熒光檢測器進行檢測[17]。本研究在參考相關文獻的基礎上，考慮到紫外檢測器應用廣泛、線性范圍和檢測靈敏度較高等優點，將Hcy還原、柱前衍生后采用紫外檢測器檢測，建立了Hcy的HPLC紫外檢測方法。另外，血漿樣品處理復雜，存在很多干擾因素，不利于快速篩選和研究蒜酶對Hcy的催化裂解作用，故又建立了體外篩選Hcy的體系和檢測方法，人體血漿中99%為[O]-Hcy，購買的Hcy試劑即為[O]-Hcy，可實現這一體系。另外，Hcy對照品為[H]-Hcy，以其制作標準曲線后作為衍生化反應的反應物對樣品的前處理條件(還原反應及衍生化反應)進行考察。為了更好地考察還原反應和衍生化反應，2個反應分別采用了2種色譜條件，均能實現待測物與反應液中各成分的分離，該方法與血漿中Hcy的分析方法類似，但省去了血漿樣品前處理的繁瑣步驟，準確靈敏，快速簡便，可作為體外篩選和評價預防和治療高同型半胱氨酸藥物的手段。

Hcy升高作為心腦血管疾病的危險因素，正日益受到學者們的重視。本實驗依據Hcy是氨基酸半胱氨酸的異種，其結構與蒜酶最適底物蒜氨酸的結構具有相似性，探索蒜酶對同型半胱氨酸是否具有催化裂解作用，以已建立的[H]-Hcy的HPLC分析方法測定蒜酶與不同濃度[O]-Hcy反應前后[H]-Hcy的含量變化，發現該酶類具有一定的催化裂解作用，可使后者轉化率達80%以上。另外，Hcy易溶于酸性溶液，故本實驗首先用pH 5.5磷酸鹽緩沖液研究體外蒜酶對Hcy的催化動力學，測得其Km為4 710 μmol/L。人體體液pH約在7左右，為了更接近該數值，本實驗選擇pH 6.8磷酸緩沖鹽研究蒜酶對Hcy的催化動力學，測得其Km為316.78 μmol/L，小于pH 5.5下的Km值，表明蒜酶與[O]-Hcy的親和力較好。

4 結論

本實驗建立了Hcy的HPLC紫外檢測方法，通過測定其減少量來探索蒜酶對同型半胱氨酸是否具有催化裂解作用，可為尋找降低體內Hcy的潛在藥物在心血管系統疾病診斷與防治中的應用提供參考。