參芪復方對2型糖尿病大鼠骨骼肌細胞凋亡的作用

任雪交， 吳賢波， 丁若蘭， 朱海燕， 唐宋琪

(1.成都中醫藥大學，四川 成都 610037；2.成都體育學院，四川 成都 610041；3.成都中醫藥大學附屬醫院，四川 成都 610072；4.成都醫學院臨床醫學院第一附屬醫院，四川 成都 610500；5.海南醫學院，海南 海口 571199)

糖尿病骨骼肌病變由糖尿病狀態下高血糖持續對骨骼肌及相應血管神經的損害而引發，是2型糖尿病(T2DM)的常見并發癥之一，臨床主要表現為肌無力，肌肉萎縮等[1-2]。參芪復方由人參、黃芪、山藥、山茱萸、生地、天花粉、丹參、制大黃組成，具有益氣健脾、清熱生津、活血化瘀的功效，臨床觀察該方可明顯改善糖尿病患者的肌肉萎軟無力、疼痛、萎縮等癥狀。前期實驗研究表明[3]，參芪復方可改善2型糖尿病大血管病變模型小鼠的糖脂代謝和血管損害，減輕模型動物的骨骼肌細胞萎縮、水腫、斷裂和炎癥狀況，對糖尿病小鼠的骨骼肌具有保護作用。但其作用機制尚不明確。

許多研究表明，肌纖維細胞凋亡在肌肉萎縮中起重要作用[4-6]，且以線粒體功能障礙而激發的細胞凋亡為主要貢獻者[7-10]，而Bcl-2家族是介導線粒體損傷引起細胞凋亡的重要成員。因此，本研究擬從骨骼肌線粒體相關凋亡蛋白切入，進一步探究參芪復方對糖尿病骨骼肌細胞凋亡的影響及作用機制。

1 材料

1.1 動物及飼料 30只自發性2型糖尿病GK大鼠，SPF級，雄性，8周齡，體質量(210±10)g；10只Wistar大鼠，SPF級，雄性，8周齡，體質量(210±10)g，均購自常州卡文斯實驗動物有限公司，動物生產許可證號SCXK(蘇)2016-0010。普通飼料和高脂飼料(基礎飼料55%，脂肪10%，膽固醇10%，糖20%，奶粉5%，另加少量微量元素)均由恩施維爾公司提供。

1.2 藥物 參芪復方水煎液由成都中醫藥大學附屬醫院藥劑科提供(批號20190420)，所用藥材均由成都中醫藥大學黃巍教授鑒定為正品。羅格列酮(批號190304，成都恒瑞制藥有限公司)。

1.3 試劑 蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物(貨號P1050)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號P0010)、RIPA裂解液(貨號P0013B)、PMSF(貨號ST506)均購于上海碧云天生物技術有限公司；Bak抗體(貨號12105，美國Cell Signaling Technology公司)；Bad抗體(貨號ab32445)、Bax抗體(貨號ab32503)、Bcl-2抗體(貨號ab196495)、Bcl-xL抗體(貨號ab178844)、Prism Ultra Protein Ladder(貨號ab116028)、Goat anti-Rabbit IgG(H+L) Secondary Antibody HRP(貨號ab205118)、Anti-COX Ⅳ antibody (HRP) (貨號ab209958)均購于英國Abcam公司；大鼠ACTB內參引物(貨號B661202)、大鼠RPS18內參引物(貨號B661201)均購于生工生物工程上海(股份)有限公司；RT EasyⅡ(貨號RT-01023)、Animal Total RNA Isolation Kit(貨號RE-03011)均購于成都福際生物技術有限公司；SsoAdvanced Universal SYBRGreen Supermix(貨號1725271)、Clarity Western ECL Substrate(貨號170-5060)均購于美國Bio-Rad公司。

1.4 儀器 TSJ-Ⅱ型全自動封閉式組織脫水機、BMJ-Ⅲ型包埋機、PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀均購于常州中威電子儀器有限公司；轉輪式切片機(德國徠卡公司)；DeadEnd TM熒光測定TUNEL系統[普洛麥格(北京)生物技術有限公司]；血糖儀(美國Abbott Diabetes Care公司)；電泳儀、熒光定量PCR(美國Bio-Rad公司)；酶標儀(美國ThermoFisher公司)；超微量核酸分析儀(德國IMPLEN公司)；基因擴增儀(杭州朗基科學儀器有限公司)；全自動化學發光凝膠成像系統(北京賽智創業科技有限公司)。

2 方法

2.1 藥液制備 參芪復方水煎液制備工藝，稱取人參15 g、黃芪15 g、山藥10 g、山茱萸10 g、生地10 g、天花粉10 g、丹參10 g、酒制大黃6 g，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，濾過，收集濾液；再加入8倍量水，煎煮30 min，濾過，合并2次濾液，減壓濃縮至含生藥量2 g/mL。參芪復方受試藥液配制，取參芪復方水煎液30 mL，加生理鹽水10 mL，配制成1.5 g/mL混懸液備用。羅格列酮混懸液配制，取羅格列酮1粒，碾碎后加入生理鹽水57.1 mL，配制成0.07 mg/mL混懸液備用。

2.2 造模方法 將2型糖尿病模型大鼠適應性飼養1周后，換以高脂飼料喂養，每周監測隨機血糖，連續3 d檢測隨機血糖≥11.1 mmol/L視為造模成功。造模37 d，給藥期間同時給予高脂飼料喂養。

2.3 分組及干預 課題組前期實驗研究發現，參芪復方臨床等效劑量的10倍劑量對2型糖尿病動物模型的血糖、血脂代謝紊亂和骨骼肌病變的改善作用最佳[1]，因此本實驗選擇了10倍劑量的參芪復方作為中藥組。造模成功后，將2型糖尿病大鼠模型隨機分為3組，即模型對照組、參芪復方組、羅格列酮組，每組10只，另取10只Wistar大鼠為正常對照組。參芪復方組灌胃給予14.33 g/kg參芪復方混懸液，羅格列酮組灌胃給予0.67 mg/kg羅格列酮混懸液，正常對照組、模型對照組均灌胃等體積生理鹽水。每天1次，連續給藥8周，8周后處死大鼠。

2.4 標本采集 實驗結束后，標本采集處死前12 h禁食不禁水，以2%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉后置于冰盤上，迅速剝離腓腸肌，并切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小塊以10%的多聚甲醛固定，剩余腓腸肌組織分裝至EP管并標記后投入液氮中，于-80 ℃冰箱保存待測。

2.5 骨骼肌細胞凋亡率檢測 將10%多聚甲醛固定的腓腸肌組織制成石蠟切片，切片常規脫蠟至水，以水浸泡5～10 min，浸入PBS漂洗2次，每次5 min；制備TUNEL反應混合液，孵育8～10 min，避光將切片浸入PBS漂洗3次，每次5 min，甘油封片，熒光顯微鏡檢測，每張切片隨機選取3個視野，進行凋亡細胞分析。

2.6 RT-qPCR檢測骨骼肌組織中目的基因表達 用液氮將大鼠腓腸肌組織研磨成粉末狀，按Animal Total RNA Isolation Kit說明書提取RNA，微量核酸分析儀檢測RNA質量濃度和純度，將樣本RNA質量濃度調整為84 ng/μL，RT EasyⅡ試劑盒將mRNA樣本逆轉錄為cDNA(2×RT OR-EasyTM Mix溶液10 μL，樣本10 μL；42 ℃ 15 min逆轉錄，85 ℃ 5 min失活)，SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix試劑盒檢測目標mRNA相對表達量，以ACTB和RPS18作為歸一化內參基因。PCR反應體系(20 μL)為2×SYBR Green mixture 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase Free water 7.4 μL；進行40個PCR循環，循環后進行熔解曲線實驗，觀察擴增產物有無非特異性擴增及擴增片段長度。PCR引物序列見表1。

表1 基因引物序列

2.7 Western blot檢測骨骼肌組織中目的蛋白表達 剪取100 mg大鼠腓腸肌組織，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制劑的RIPA混合裂解液，冰上勻漿，4 ℃裂解1 h后離心(12 000 r/min，5 min)，收集上清液，BCA法檢測總蛋白濃度，每孔以20 μg蛋白上樣，100 V電泳，100 V濕轉，5%脫脂牛奶封閉2 h，加入相應一抗，4 ℃孵育16 h，二抗室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影，化學發光成像系統曝光拍攝，凝膠分析系統分析條帶凈光密度值。

3 結果

3.1 參芪復方對大鼠骨骼肌細胞凋亡的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨骼肌細胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型對照組比較，羅格列酮組與參芪復方組大鼠骨骼肌細胞凋亡率降低(P<0.05)；羅格列酮組與參芪復方組比較大鼠骨骼肌細胞凋亡率無明顯變化(P>0.05)，見圖1、表2。

注：綠色熒光標示凋亡細胞，藍色熒光標示細胞核。圖1 各組大鼠骨骼肌細胞凋亡情況(TUNEL熒光染色，×400)

表2 各組大鼠骨骼肌細胞凋亡率

3.2 參芪復方對大鼠骨骼肌組織Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xLmRNA表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨骼肌組織BadmRNA表達升高(P<0.05)，Bcl-xLmRNA表達降低(P<0.05)；與模型對照組比較，羅格列酮組大鼠骨骼肌組織BadmRNA表達降低(P<0.05)，參芪復方組大鼠骨骼肌組織BakmRNA表達降低(P<0.05)、Bcl-2 mRNA表達升高(P<0.05)，見表3。

3.3 參芪復方對大鼠骨骼肌組織Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨骼肌組織Bad、Bax蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)；與模型對照組比較，羅格列酮組大鼠骨骼肌組織Bad、Bax蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，參芪復方組大鼠骨骼肌組織Bad、Bax蛋白表達均降低(P<0.05，P<0.01)、Bcl-2蛋白表達升高(P<0.01)，見圖2、表4。

表3 各組大鼠骨骼肌組織Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表達

圖2 各組大鼠骨骼肌組織Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白條帶圖

表4 各組大鼠骨骼肌組織Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達

4 討論

骨骼肌是全身葡萄糖吸收的重要組織之一，也是胰島素作用的主要靶組織之一，對維持機體葡萄糖動態平衡具有關鍵性作用。長期處于高血糖環境下的骨骼肌易受損害，其中以氧化型肌纖維受損最為突出，在光鏡下主要表現為肌纖維萎縮[11]。研究發現，其發病機制可能與線粒體損傷引起的細胞凋亡有關。Kelley等[12]在2型糖尿病患者的肌肉中觀察到線粒體破裂。蒙碧輝等[13]發現，樹鼩糖尿病模型的肌組織中存在明顯的線粒體損傷和細胞凋亡前狀態，提示細胞凋亡可能與糖尿病骨骼肌病變相關。本實驗骨骼肌組織TUNEL熒光染色顯示，模型對照組大鼠骨骼肌細胞凋亡率高于正常對照組，這進一步說明骨骼肌細胞凋亡可能參與糖尿病骨骼肌病變的發生；參芪復方組與羅格列酮組大鼠骨骼肌細胞凋亡率低于模型對照組，提示參芪復方可改善2型糖尿病大鼠模型的骨骼肌細胞凋亡現象。

Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白共屬于B細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，其中Bcl-2、Bcl-xL屬于抗凋亡成員，Bad、Bak、Bax屬于促凋亡成員。Bcl-2家族在調節細胞凋亡信號上起重要作用，可結合相關蛋白調節線粒體的穩態，參與線粒體外膜孔道的形成，與線粒體外膜通透性有關[14]。細胞色素C(Cyt C)是一種細胞色素氧化酶，位于線粒體內膜外側，是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，也是一種重要的細胞凋亡調控因子[15]。Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡成員可抑制線粒體釋放Cyt C，Bak、Bad、Bax等促凋亡成員則促進線粒體釋放Cyt C。在細胞內凋亡刺激因子作用下，促凋亡蛋白Bak、Bax等在線粒體外膜上形成線粒體內部通向胞質的孔道，使得Cyt C得以通過線粒體外膜進入細胞質，并在ATP的作用下與凋亡酶激活因子(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)組成凋亡小體，引起下游與細胞生命相關蛋白的降解，最終引起細胞凋亡[16-17]。

本實驗研究發現，與正常對照組比較，模型對照組大鼠骨骼肌組織BadmRNA表達升高、Bcl-xLmRNA表達降低，而Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL的蛋白表達均有明顯的改變，證實Bcl-2家族參與了2型糖尿病大鼠模型的骨骼肌細胞凋亡過程；與模型對照組比較，參芪復方組大鼠骨骼肌BakmRNA表達與Bad、Bax蛋白表達均降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表達均升高。提示參芪復方可影響2型糖尿病大鼠模型骨骼肌細胞Bcl-2家族中促凋亡成員Bak、Bad、Bax以及抗凋亡成員Bcl-2的表達。

綜上所述，參芪復方可通過調控Bak、Bad、Bax、Bcl-2的表達，減少2型糖尿病大鼠模型骨骼肌細胞凋亡，從而發揮改善糖尿病骨骼肌病變的作用。