紅花清肝十三味丸對急性肝損傷大鼠的影響

盧任玲， 馬麗杰

(1.山東藥品食品職業學院，山東 威海 264210；2.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010059)

急性肝損傷通常是由于微生物感染、濫用藥物、過度飲酒等造成的肝功能突然異常，是肝硬化和肝癌的主要始動因素。若未及時治療會迅速惡化，可能會發展成為急性肝衰竭[1]。目前國內外尚無理想的治療肝損傷藥物，因此開發及篩選有效藥物逆轉肝損傷的發生發展已成為目前研究的熱點。臨床上針對急性肝損傷，多采用保肝降酶等治療方案，以改善其臨床癥狀，促進機體恢復。隨著中醫藥現代化研究進展，中藥在治療急性肝損傷起到了很好的臨床療效，逐漸成為研究熱點[2-3]。

紅花清肝十三味丸出自《中國醫學百科全書·蒙醫學》，是由紅花、牛黃、紫檀香3味主藥，水牛角、木香、梔子、川楝子、訶子、麥冬等10味輔藥組成的中藥復方制劑。蒙醫認為，該復方中的君藥紅花可以清肝熱，調經、活血消腫；梔子、紫檀香可以清血熱；銀朱可以清脈熱；水牛角可以清熱、涼血、解毒；麥冬可以清希拉熱。各藥合用對治療肝熱癥及肝功減退有很好的療效[4]。研究證明，紅花清肝十三味丸在臨床治療慢性脂肪性肝炎、慢性乙型肝炎療效顯著[5-6]。然而，在治療急性肝損傷方面的研究仍然匱乏。本研究旨在建立CCl4誘導的急性肝損傷模型，研究紅花清肝十三味丸對急性肝損傷大鼠的保護作用，并初步探究其作用機制，為臨床合理用藥提供依據。

1 材料

1.1 動物 雄性Wistar大鼠48只，體質量(200±20) g，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，動物生產合格證號SCXK-(軍)2012-0004，溫度20～25 ℃，相對濕度40%～70%，每天光照12 h，自由攝食飲水。

1.2 試劑與藥物 紅花清肝十三味丸 (批號168172) 購自內蒙古蒙藥股份有限公司；水飛薊賓膠囊 (批號H20040299) 購自天士力制藥集團。谷丙轉氨酶 (ALT，批號C009-3-1)、堿性磷酸酶 (ALP，批號A059-1-1)、總蛋白 (TP，批號A095-2-1)、丙二醛 (MDA，批號A003-1-2)、過氧化氫酶 (CAT，批號A007-1-1) 檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，批號BC1195) 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；TNF-α (批號ab6671)、IL-6 (批號ab208113)、iNOS (批號ab3523)、caspase-3 (批號ab13847)、cleaved caspase-3 (批號ab2302) 抗體購自英國Abcam公司；IL-1β(批號12703s) 購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3 藥物配制 藥物研磨成細粉后過篩，加1%吐溫80研磨均勻，加蒸餾水溶解并稀釋，分別配成質量濃度為0.025、0.05、0.1 g/mL 的紅花清肝十三味丸灌胃液和質量濃度為0.01 g/mL的水飛薊賓灌胃液，用前搖勻。將CCl4與花生油按1∶1比例混勻，配制造模液。

1.4 儀器 CTR6000熒光顯微鏡(德國Leica公司)；Centrifuge 5415R低溫高速離心機(德國Eppendorf公司)；Tanon-5200化學發光成像分析儀(北京原平皓生物技術公司)；Multiskan MK3酶標儀、HM355S全自動石蠟切片機(美國Thermo公司)。

2 方法

2.1 分組及給藥 48只大鼠適應性喂養1周后，隨機分為正常對照組，模型組，紅花清肝十三味丸低、中、高劑量組 (0.25、0.5 g、1 g/kg，分別相當于臨床成人日用量0.5、1、2倍的等效量)，水飛薊賓組 (0.1 g/kg)，每組8只，正常對照組和模型組灌胃給予蒸餾水，其余各組大鼠灌胃給予相應藥物，給藥量均為1 mL/100 g，每天1次，持續8 d。

2.2 模型的建立 末次灌胃給藥1 h后，正常對照組大鼠腹腔注射1 mL/kg的花生油，模型組、給藥組大鼠注射同樣劑量的造模液，給藥量均為0.1 mL/100 g。大鼠禁食不禁水24 h后，水合氯醛麻醉處死，剝離肝臟。

2.3 生化指標檢測 按照試劑盒說明，將各組血液以3 500 r/min離心10 min，取上清液，檢測血清ALT、ALP、TP 水平；取大鼠肝臟，制備肝組織勻漿，檢測MDA水平及CAT、GSH-Px活性。

2.4 肝組織形態學檢測 取大鼠肝臟右小葉組織于10%福爾馬林固定后，經組織脫水、透蠟、包埋、切片、脫脂脫蠟后蘇木精-伊紅(HE)染色，在光學顯微鏡下觀察肝組織結構改變。

2.5 肝細胞凋亡率檢測 取少量新鮮大鼠肝組織加入胰酶，恒溫37 ℃消化30 min，10%胎牛血清終止消化，收集細胞懸液，800 r/min離心5 min，棄上清，加入PBS洗滌2次，棄上清，加人膜聯蛋白V-碘化丙啶(Annexin V-PI) 進行聯合染色，上機檢測凋亡率。

2.6 肝組織炎癥、凋亡蛋白檢測 采用Western blot法。取大鼠肝臟組織，加入預冷的RIPA裂解液提取蛋白后測定其濃度，SDS-PAGE凝膠分離蛋白并轉移至NC膜上，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗稀釋液，4 ℃冰箱過夜；TBST洗滌3次，加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，TBST洗滌3次，加入ECL發光液顯影和定影，使用Tanon-5200化學發光成像分析儀掃描，統計灰度值并計算相對表達量。以β-actin為內參，結果以待測因子與β-actin條帶灰度值的相對比值表示(待測因子正常組比值為1)。

3 結果

3.1 紅花清肝十三味丸對大鼠肝功能指標的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠血清ALT、ALP水平升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組大鼠兩者水平降低(P<0.01)；急性肝損傷后，各組大鼠血清TP水平無顯著差異 (P>0.05)，見表1。

表1 紅花清肝十三味丸對大鼠肝功能指標的影響

3.2 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟氧化應激指標的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肝臟組織中MDA水平升高 (P<0.01)，CAT、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組大鼠肝臟MDA水平降低(P<0.01)，紅花清肝十三味丸中、高劑量組和水飛薊賓組大鼠CAT、GSH-Px活性升高(P<0.01)，見表2。

表2 紅花清肝十三味丸對大鼠臟氧化應激指標的影響

3.3 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟組織形態學的影響 如圖1所示，正常對照組大鼠肝臟小葉結構清晰，小葉肝板排列整齊，未見明顯炎癥；模型組肝小葉結構紊亂，中央靜脈周圍多數融合壞死，多數肝細胞腫脹呈氣球樣變，易見凋亡小體，竇細胞反應活躍，伴混合性炎細胞浸潤；而紅花清肝十三味丸組和水飛薊賓組肝小葉損傷程度明顯改善，中央靜脈周圍小壞死灶和凋亡小體明顯減少，炎細胞浸潤明顯減輕。

3.4 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟炎癥指標的影響 與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、IL-6、iNOS的蛋白表達升高 (P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組、水飛薊賓組四者蛋白表達降低 (P<0.01)，并呈劑量依賴性，見表3、圖2。

3.5 紅花清肝十三味丸對大鼠肝細胞凋亡的影響 如表4、圖2所示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝組織cleaved caspase-3表達升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組大鼠肝組織cleaved caspase-3表達降低(P<0.01)，但各組caspase-3蛋白表達無顯著差異 (P>0.05)。

圖1 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟組織形態學的影響

表3 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟炎癥指標的影響

注：A為正常對照組，B為模型組，C為紅花清肝十三味丸低劑量組，D為紅花清肝十三味丸中劑量組，E為紅花清肝十三味丸高劑量組，F為水飛薊賓組。圖2 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟炎癥和凋亡蛋白表達的影響

表5、圖3顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠肝細胞凋亡率升高(P<0.01)；與模型組比較，紅花清肝十三味丸組和水飛薊賓組肝細胞凋亡率降低(P<0.01)。

4 討論

肝臟作為人體中最大的消化腺，在機體解毒和主代謝中的作用舉足輕重[7]。近年來，中藥材被廣泛用于治療肝病。紅花清肝十三味丸作為蒙醫傳統藥方，在保肝方面具有極高的藥用價值[8]。CCl4可誘導產生大量自由基，破壞肝細胞膜，導致膜通透性增強，最終引起血清ALT和ALP水平升高，二者通常作為診斷肝損傷嚴重程度的指標[9-10]。研究發現，模型組大鼠血清ALT和ALP水平升高。此外，臨床診斷通常通過肝臟病理改變作為急性肝損傷的檢驗標準。本研究的病理切片染色結果表明，模型組肝小葉結構紊亂，中央靜脈周圍和小葉周圍帶可見多數壞死灶，多數肝細胞腫脹呈氣球樣變，伴混合性炎細胞浸潤，竇細胞反應活躍，結合血清指標表明急性肝損傷模型建立成功。而紅花清肝十三味丸組能使ALT、ALP 水平降低，且能抑制CCl4引起肝臟的病理學改變和損傷，表明其在保護肝細胞膜穩定性及減輕肝臟損傷程度上起著重要作用。此外，紅花清肝十三味丸對蛋白合成相關的TP作用并不顯著，這表明其保肝作用并不影響肝臟合成蛋白功能。

表4 紅花清肝十三味丸對大鼠肝臟凋亡蛋白的影響

圖3 紅花清肝十三味丸對大鼠肝細胞凋亡率的影響

表5 紅花清肝十三味丸對大鼠肝細胞凋亡率的影響

機體含有多種酶促(例如，GSH-Px和CAT)和非酶促(例如，抗壞血酸)的抗氧化劑，以維持內源性氧化還原平衡。CCl4可通過誘導自由基的產生，使得平衡被打破，造成肝臟發生脂質過氧化反應，導致細胞、線粒體等生物膜的流動性降低，通透性增高，組織內抗氧化酶活性降低，肝臟抵御氧化損傷能力下降，進而引起肝臟損傷[11]。MDA是自由基攻擊生物膜多不飽和脂肪酸最終產物，通常用于監測脂質過氧化反應程度[12]。本研究發現，紅花清肝十三味丸組能提高CAT、GSH-Px活性，減少MDA積聚，表明藥物通過增加抗氧化酶的活力，清除自由基及減少脂質過氧化反應，從而減輕CCl4引起的肝損傷。

大多數肝損傷的病理進程都伴隨炎癥反應的發生，肝臟氧化應激與炎癥的發生密切相關。氧化應激能夠激活機體的Kupffer 細胞，釋放出大量的促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6等，而這些介質能作用于內皮細胞、肝星狀細胞和肝細胞，隨后募集免疫細胞以引發炎癥反應[13]。此外，當肝組織損傷時，肝臟中大量表達iNOS，催化大量NO產生，參與肝炎的發病過程，對肝臟具有毒性作用[14]。研究發現，紅花清肝十三味丸組能夠抑制模型組 TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS蛋白的表達，表明藥物通過抑制炎癥反應減輕CCl4引起的肝損傷。

細胞凋亡在肝炎的產生、發展中的作用至關重要。caspase-3對凋亡具有執行功能，當caspase-3被激活后斷裂為cleaved caspase-3片段，則會啟動凋亡過程，是凋亡發生的直接原因[15]。本研究發現，模型組肝細胞的凋亡率升高，凋亡蛋白cleaved caspase-3蛋白的表達增加，紅花清肝十三味丸組能明顯抑制二者的升高，表明藥物通過抑制凋亡減輕CCl4引起的肝損傷。

綜上所述，紅花清肝十三味丸可通過抑制氧化損傷、炎癥反應，減輕肝細胞凋亡，來改善大鼠的急性肝損傷。然而，關于紅花清肝十三味丸在發揮保肝作用的具體機制有待進一步研究。