補腎活血方干預小鼠膝骨關節炎軟骨修復的機制

李 興， 肖方駿， 李 震， 翁家賢， 羅明輝， 潘建科， 陳紅云， 楊偉毅*

(1.廣州中醫藥大學第二附屬醫院運動醫學科，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫藥大學，廣東 廣州 510405)

膝骨關節炎好發于中老年人群，是臨床中發病率較高的一種退行性膝關節疾患，以膝關節軟骨的變性、破壞及骨贅形成為主要臨床特征，臨床上患者常以膝關節出現反復的疼痛、爬樓梯或下蹲困難為主訴，嚴重者，后期可發展為關節畸形，致殘率高達53%，給患者的工作和生活造成了嚴重的干擾[1-2]。目前，針對膝骨關節炎主要治療包括保守方案及手術方案，但尚無特效的治療方法，而中醫藥在保守治療方面有著巨大的潛力。補腎活血方源自于廣東省中醫院院內制劑腎骨安，前期的研究已證實了其臨床療效[3-4]，本研究意圖借助病理學、分子生物學、影像學等多學科聯合手段，研究補腎活血方對小鼠膝關節骨關節炎模型的干預作用，并進一步探究其作用機制。

1 材料

1.1 動物 SPF級10周齡C57BL/6雄性小鼠32只，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK(粵)2018-0034，飼養于廣州中醫藥大學SPF動物實驗中心，實驗動物倫理審查號20200911001，實驗動物使用許可證號SYXK(粵)2018-001，自由攝水飲食，晝夜節律為12 h/12 h，環境溫度 (24±2) ℃，相對濕度55%～68%，適應性喂養1周后開始進行實驗研究。

1.2 藥物 補腎活血方每劑含丹參15 g，巴戟天10 g，仙茅10 g，熟附子10 g，由廣州中醫藥大學第二附屬醫院提供。

1.3 試劑及儀器 膠原蛋白Ⅱ(Collagen Ⅱ)(貨號gb12021)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)抗體(貨號gb11247)均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；DAB Substrate Kit(貨號8059S)購自美國Cell Signaling Technology公司；番紅O-固綠軟骨染色試劑盒(貨號G1371)購自北京索萊寶科技有限公司；TB GreenTMPremix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)(貨號TRR820A)、Reverse Transcription Kit(貨號TRR820A)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(貨號RR037A)均購自日本Takara公司。倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；CFX96實時熒光定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；Micro-CT(型號Skyscan 1172，德國Bruker公司)。

2 方法

2.1 動物模型建立與分組 按照隨機數字表法將32只小鼠分為假手術組、模型組、補腎活血方低劑量組和補腎活血方高劑量組，每組8只。根據文獻方法制備膝骨關節炎模型[5-6]小鼠，腹腔注射3%戊巴比妥鈉(35 mg/kg)進行全身麻醉，將小鼠固定、備皮、消毒，隨后使用內側髕旁入路暴露右膝，將髕骨后翻, 使膝關節保持最大屈曲狀態, 暴露關節腔, 利用顯微器械切斷膝前交叉韌帶, 避免損傷軟骨, 切斷后用抽屜實驗檢驗前交叉韌帶是否被切斷。8周后，處死小鼠，取出膝關節并固定在4%多聚甲醛中用于后續實驗。

2.2 給藥方法 造模成功后，次日開始對給藥組進行灌胃干預，每天1次，每6 d間歇1 d。補腎活血方低、高劑量組分別給予0.46、0.92 g/mL的補腎活血方進行灌胃，每次每只小鼠灌胃0.3 mL，假手術組及模型組分別給予0.3 mL蒸餾水進行灌胃，連續干預8周。

2.3 組織學觀察 將組織樣品轉移到10% EDTA溶液中進行完全脫鈣、脫水和石蠟包埋。在膝關節內側隔室中沿矢狀面方向切成5 μm厚，并用蘇木精和伊紅(HE)和番紅-固綠(safranin O-fast green staining，SO)染色。通過應用OARSI評分系統[7]評價小鼠關節軟骨的退變程度。0分為表面完整，軟骨完好無損；1分為表面完整；2分為表面不連續；3分為垂直裂縫；4分為侵蝕；5分為剝蝕；6分為變形。將內側股骨和脛骨平臺分數相加(0～12分)以評價關節軟骨退變的程度。

2.4 RT-qPCR法檢測小鼠關節軟骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表達 按照Trizol法提取總RNA，各組RNA取500 ng按照TaKaRa逆轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，并進行RT-qPCR分析，參數為 95 ℃ 30 s，預變性;95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，擴增40個循環。參考熔解曲線為依據進行質控，檢測樣品中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α及MMP13的mRNA表達，并以GAPDH作為內參，使用2-△△CT法分析結果。所有引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司設計。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.5 免疫組化檢測小鼠關節軟骨中Collagen Ⅱ、MMP-13蛋白表達 小鼠組織切片脫蠟、抗原修復、血清封閉后，用兔多克隆抗體工作液稀釋的Collagen Ⅱ、MMP-13抗體(1∶100)進行孵育，再將其與二抗工作液一起孵育，最終顯色試劑顯色，復染蘇木精后，切片脫水、封片。鏡下觀察，并采集圖像，然后通過Image J 軟件對陽性點進行定量，計算每個標本的陽性染色細胞數，每組小鼠取3個連續標本進行分析。

2.6 Micro-CT掃描評價小鼠膝關節中骨小梁破壞及附近骨贅增生狀況 將樣本置于含有70%乙醇的離心管中，并使用Micro-CT進行掃描[8-9]。將整個脛骨平臺軟骨下骨組織設置為興趣區域(region of interest，ROI)，并采集膝關節的解剖結構三維重建的圖像，采集相關的組織學參數，骨體積(bone volume, BV)、骨體積/總組織體積(bone volume/total tissue volume,BV/TV)和骨小梁數量(trabecular.number,Tb.N)、厚度(trabecula.thickness,Tb.Th)和間距(trabecular.separation,Tb.Sp)。

3 結果

3.1 補腎活血方對小鼠關節軟骨病理HE、SO染色及評分的影響 如圖1A～1B所示，模型組小鼠關節軟骨部分區域出現明顯缺損，補腎活血方低劑量組小鼠關節軟骨表面磨損較模型組有所減輕，而補腎活血方高劑量組小鼠軟骨表面可見侵蝕現象明顯改善。評分如圖1C所示，與假手術組比較，模型組小鼠OARSI評分升高(P<0.05)，提示小鼠造模成功；與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組小鼠評分降低(P<0.05)。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。比例尺50 μm。圖1 各組小鼠關節軟骨病理染色及評分圖(×20)

3.2 補腎活血方對小鼠關節軟骨中COX-2、iNOS、MMP13、TNF-α、IL-6 mRNA表達的影響 如圖2所示，與假手術組比較，模型組小鼠關節軟骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表達升高(P<0.05);與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組小鼠關節軟骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表達降低(P<0.05)。

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。圖2 各組小鼠關節軟骨中COX-2、iNOS、MMP13、TNF-α、IL-6 mRNA表達

3.3 補腎活血方對小鼠關節軟骨中Collagen Ⅱ、MMP-13蛋白表達的影響 如圖3所示，與假手術組比較，模型組小鼠關節軟骨中MMP-13的陽性表達增加(P<0.05)，Collagen Ⅱ的陽性表達降低(P<0.05)；與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組小鼠關節軟骨中MMP-13的陽性表達降低(P<0.05)，Collagen Ⅱ的陽性表達增加(P<0.05)。結果表明，使用補腎活血方后，小鼠關節軟骨損傷的現象明顯改善。

3.4 補腎活血方提高小鼠膝關節中骨小梁密度及減少關節周圍骨贅增生 Micro-CT掃描三維重建結果如圖4A所示，假手術組小鼠膝關節軟骨均是健康軟骨，未見明顯的骨質破壞及增生；而模型組及補腎活血方低、高劑量組小鼠膝關節軟骨均有不同程度的變化。從膝關節內側矢狀面圖像(圖4B)分析，假手術組小鼠膝關節下骨小梁連續、密集、完整；模型組小鼠膝關節骨小梁不完整、疏松并斷裂；與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組小鼠膝關節在矢狀位上骨小梁厚度明顯增加。從骨計量參數分析的結果(圖4C)來看，與假手術組比較，模型組小鼠ROI區域的BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N水平均下降(P<0.05)，Tb.Sp水平升高(P<0.05)；與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組小鼠ROI區域的BV、BV/TV、Tb.Th、Tb.N水平均升高(P<0.05)，Tb.Sp水平下降(P<0.05)。結果表明，補腎活血方能夠改善關節炎小鼠ROI區域的BV、BV/TV、Tb.Sp、Tb.Th、Tb.N水平。

4 討論

注：A～B為MMP-13、Collagen Ⅱ免疫組化染色，C～D為MMP-13、Collagen Ⅱ免疫組化染色直方圖。與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。比例尺50 μm。圖3 各組小鼠關節軟骨中MMP-13、Collagen Ⅱ蛋白表達(×20)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。比例尺50 μm。圖4 各組小鼠關節軟骨Micro-CT掃描結果

中醫古籍中并無膝骨關節炎這一稱謂，根據其相關癥狀，多將其從“骨痹”論治[10-11]，《素問》中記載，“肝氣衰，筋不能動，天癸竭，精少，腎臟衰，形體皆極”，首先提出在中老年患者膝骨關節炎中，肝腎不足是其基本病機。同時，氣血作為人體的基本營養物質，但凡損傷，必有氣血運行障礙，誠如《正體類要》中所言“肢體損于外，則氣血傷于內”。因而，當前對膝骨關節炎中醫病因病機的認識，多以腎虛血瘀為主，以補腎活血法治之[12-13]。本研究以此為理論基礎，采用的補腎活血方是根據廣東省名中醫鄧晉豐教授多年臨床經驗所創制，全方由巴戟天、丹參、熟附子、仙茅四藥組成，寒熱兼施，有補腎強筋，活血通絡之功效，臨床療效顯著[3-4]。同時，現代藥理學研究證實，中藥丹參[14]和附子[15]的活性成分可以有效抑制炎性因子釋放，而其干預膝骨關節炎的機制可能與減少MMPs釋放，進而抑制關節軟骨基質的降解有關。

MMPs是細胞外基質降解中主要的蛋白酶系統，被認為是機體生理重建和病理破壞的主要基礎因素之一[16]。MMP-13作為已知酶系中最高效的膠原酶，可以直接降解軟骨基質中的Collagen Ⅱ，在膝骨關節炎病理過程中，MMP-13常呈過表達的狀態，造成細胞外基質的過度降解，使軟骨的完整性破壞[17]。因此，理論上來說，軟骨破壞程度越嚴重，MMP13的表達越高[18]。同時，既往研究發現，IL-6、TNF-α等炎性因子可以通過不同途徑活化MMPs[19-20]。本研究通過實驗發現膝骨關節炎模型小鼠關節軟骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α等炎性相關因子與MMP-13的mRNA表達均有不同程度增高，與文獻結果一致。

根據本研究中HE染色、SO染色及Micro-CT的結果，發現造模后的C57BL/6小鼠出現了顯著的關節軟骨增生，及軟骨下骨破壞的組織學改變，符合膝骨關節炎的特點。補腎活血方干預8周后，與模型組比較，補腎活血方低、高劑量組有著不同程度的改善小鼠膝骨關節炎組織學形態的作用。同時，RT-qPCR、免疫組化的結果發現，與模型組比較，低劑量組、高劑量組小鼠關節軟骨中iNOS、COX-2、IL-6、TNF-α、MMP13 mRNA表達降低(P<0.05)，而Collagen Ⅱ表達高(P<0.05)。同時，本研究還發現補腎活血方在治療膝骨關節炎過程中存在劑量相關性，隨著用藥劑量增加，膝骨關節炎小鼠的炎性因子表達降低。

綜上所述，本研究發現補腎活血方可以有效減緩膝骨關節炎的軟骨損傷，其機制可能是通過抑制炎性因子的表達，進而減少MMP-13的釋放，阻止MMP-13對軟骨基質中Collagen Ⅱ的破壞，從而達到改善關節軟骨內代謝環境，保護關節軟骨的作用。本研究結果可能是補腎活血方改善膝骨關節炎的一種新型機制，但未來仍需更多的實驗研究及臨床論證，來進一步挖掘其更深入的機制。