安神養血口服液對更年期綜合征大鼠的影響

梁 鵬， 郭富雙， 蔣璐慧， 陳俐秀， 焦愛軍， 王 捷

(廣西醫科大學藥學院，廣西 南寧 530021)

更年期綜合癥是指婦女在絕經前后，由于卵巢功能的衰退或消失，導致性激素波動或減少，從而引起的一系列以自主神經系統功能紊亂為主，同時伴有神經心理癥狀的癥候群，典型的臨床表現為潮熱、潮紅、經期紊亂[1-2]。根據相關的流行病學調查統計報告顯示，我國的更年期綜合癥發生率約為60%，其中20%左右的婦女會因為癥狀嚴重而被迫就醫[3-4]。目前，西醫治療更年期綜合癥主要以雌激素補充治療為主，治療效果明顯，可有效改善各種更年期癥狀。但長期使用雌激素，會引起機體產生各種不良反應，如水鈉潴留、增加心腦血管危險性等，同時會提高子宮內膜癌、卵巢癌與乳腺癌的發生率[5]。相較而言，由于中醫藥對更年期綜合癥的治療具有療效確切，不良反應少等優點，越來越受到關注。中醫認為“腎精虧虛為其本”，腎虛是引起更年期綜合癥的根本。因此，滋陰補腎是治療更年期綜合癥的關鍵[6]。安神養血口服液，由廣西醫科大學制藥廠研發生產。其中主要含有鉤藤、金不換、制何首烏、首烏藤、松針、雞血藤、生地黃等中藥成分，當前主要用于肝血不足引起的失眠、健忘，治療效果明顯，毒副作用小。本研究采用將雌性大鼠去勢的方法建立大鼠更年期綜合癥模型[7]，研究安神養血口服液對更年期綜合癥的治療效果及其可能的作用機制，為安神養血口服液新的臨床適應癥開發提供理論依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠，雌性，體質量(200±20)g，由廣西醫科大學動物實驗中心提供，飼養環境符合SPF等級要求，實驗動物生產許可證號SCXK(桂)2014-0002，動物使用許可證證號SYXK(桂)2014-0003。給予SPF級大鼠配合飼料，自由飲用純凈水，適應性飼養1周后，開始實驗。

1.2 試劑與藥物 安神養血口服液由廣西醫科大學制藥廠提供，規格0.564 g/mL生藥，批號20180201；戊酸雌二醇片(拜耳醫藥保健有限公司，批號404A)。瑞氏染色液(合肥博美生物科技有限責任公司，批號BMB2135)；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)測試盒(南京建成生物工程研究所，批號分別為20181007、20190114)；血清雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、睪酮(T)、下丘腦多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、五羥吲哚乙酸(5-HIAA)、β-內啡肽(β-EP)ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，批號分別為E20181001A、E20181001A、E20181001A、E20181001A、E20181001A、E20181101A、E20181101A、E20181101A、E20190101A、E20190101A)。

1.3 儀器 CD-UPH-II-20 L型超純水器(成都越純科技有限公司)；DTY-ZBJ-K45型顆粒制冰機(北京德天佑科技發展有限公司)；UW620H型電子天平(日本島津公司)；TDL-5-A型臺式離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；Micro CL17R型高速低溫離心機、MULTISKAN MK3型全波長酶標儀(美國Thermo公司)；CX31+DP73型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 方法

2.1 模型制備 采用摘除大鼠雙側卵巢致大鼠去勢，制備更年期綜合征模型[8]。

2.2 分組及給藥 將70只大鼠按體質量隨機分為正常對照組(10只)、假手術組(10只)、去勢組(50只)，去勢組再隨機分為模型組，安神養血口服液低、中、高劑量組(1.36、2.73、5.46 g/kg)，戊酸雌二醇組(0.18 mg/kg)，每組10只，正常對照組、假手術組、模型組灌胃給予等量蒸餾水，其他各組灌胃給予相應藥物，每天1次，連續28 d。

2.3 采血 末次給藥24 h后，大鼠以1%戊巴比妥納麻醉后固定，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，分裝后置于-80 ℃冰箱中保存。

2.4 剖檢及取材 大鼠采血后分離子宮，保存于10%福爾馬林溶液中，HE染色用于子宮組織的病理檢查，在光學顯微鏡下觀察子宮病理變化，分離摘取大鼠下丘腦，精密稱定質量后，加入生理鹽水(1∶9)進行組織勻漿，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清液待測。

2.5 血清相關性激素水平檢測 ELISA法檢測血清血清雌二醇(E2)、促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)、促性腺激素釋放激素(GnRH)、睪酮(T)水平。

2.6 血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)水平檢測 WST-1法檢測血清SOD活性，TBA法檢測血清中MDA水平。

2.7 下丘腦組織中單胺類神經遞質及β-內啡肽水平檢測 ELISA法檢測下丘腦下丘腦多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE)、五羥色胺(5-HT)、五羥吲哚乙酸(5-HIAA)、β-內啡肽(β-EP)水平。

3 結果

3.1 安神養血口服液對大鼠臟器指數的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠子宮指數、腎上腺指數降低(P<0.05，P<0.01)，脾臟指數升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，安神養血口服液高劑量組大鼠的子宮指數、腎上腺指數升高(P<0.05，P<0.01)，脾臟指數降低(P<0.01)，見表1。

表1 安神養血口服液對大鼠臟器指數的影響

3.2 安神養血口服液對大鼠血清性激素水平的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠血清E2、T水平降低(P<0.01)，FSH、GnRH、LH水平升高(P<0.01)；與假手術組比較，正常對照組大鼠血清激素水平無顯著差異(P>0.05)，表明造模成功；與模型組比較，安神養血口服液高劑量組大鼠血清E2、T水平升高(P<0.05，P<0.01)，FSH、GnRH、LH水平降低(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 安神養血口服液對大鼠血清性激素水平的影響

3.3 安神養血口服液對大鼠下丘腦單胺類神經遞質水平的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠下丘腦5-HIAA、5-HT水平提高(P<0.01)，NE、DA水平降低(P<0.01)；與假手術組比較，正常對照組大鼠相關神經遞質水平無顯著差異(P>0.05)，表明造模成功；與模型組比較，安神養血口服液高、中劑量組大鼠下丘腦5-HIAA、5-HT水平降低(P<0.01)，NE、DA水平提高(P<0.01)，見表3。

表3 安神養血口服液對大鼠下丘腦5-HIAA、5-HT、NE、DA水平的影響

3.4 安神養血口服液對大鼠血清SOD活性及MDA水平的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠血清中SOD活性降低(P<0.01)，MDA水平提高(P<0.01)；與模型組比較，安神養血口服液各劑量組大鼠血清SOD活性均提高(P<0.05，P<0.01)，MDA水平降低(P<0.01)，見表4。

表4 安神養血口服液對大鼠血清SOD活性及MDA水平的影響

3.5 安神養血口服液對大鼠下丘腦β-EP水平的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠下丘腦β-EP水平降低(P<0.01)；與模型組比較，安神養血口服液中、高劑量組大鼠下丘腦β-EP水平升高(P<0.01)，見表5。

表5 安神養血口服液對大鼠下丘腦β-EP水平的影響

3.6 安神養血口服液對大鼠子宮組織病理變化的影響 與正常對照組、假手術組比較，模型組大鼠子宮明顯萎縮，子宮內膜萎縮變薄，內徑狹窄，子宮內腺體極少；與模型組比較，各給藥組大鼠子宮內膜厚度有所增加，子宮內徑變寬，子宮內腺體增多，見圖1。

4 討論

更年期綜合征的發病機理，其本質是卵巢功能的衰退或消失。由于卵巢是機體分泌血清雌二醇(E2)、睪酮(T)的主要器官，更年期綜合征患者體內E2、T水平會出現大幅的降低[9]。與此同時，通過負反饋調節機制，下丘腦會提高促性腺激素釋放激素(GnRH)的釋放，進而促進垂體代償性釋放促卵泡生成素(FSH)、促黃體生成素(LH)。因此，本實驗通過摘除雌性大鼠雙側卵巢的方法復制更年期綜合征模型，采用E2、T、GnRH、FSH、LH等指標以及子宮病理學評價安神養血口服液對更年期綜合征所引起的雌激素紊亂及子宮的影響。結果顯示，給予安神養血口服液干預治療后，各項指標均出現了不同程度的緩解現象，表明安神養血口服液能有效改善更年期綜合征模型大鼠的雌激素紊亂和對子宮的影響。

神經內分泌系統是機體重要的調控網絡，網絡功能的正常運轉依賴于神經遞質、激素以及免疫分子之間的相互作用[10]。研究表明，單胺類神經遞質水平的改變是引起更年期綜合征中抑郁不安、潮熱出汗、失眠多夢、狂躁易怒等癥狀的發生的重要原因[11]。實驗發現，更年期模型大鼠下丘腦羥色胺(5-HT)、五羥吲哚乙酸(5-HIAA)水平升高，去甲腎上腺素(NE)、下丘腦多巴胺(DA)水平降低，分析可能與下丘腦-垂體-卵巢軸調節有關。給予安神養血口服液干預治療后，去勢模型大鼠5-HT、5-HIAA水平降低，NE、DA水平提高，趨于正常組水平，說明安神養血口服液可有效調節更年期模型大鼠下丘腦單胺類神經遞質水平，改善其植物神經功能。

圖1 安神養血口服液對大鼠子宮組織病理變化的影響(HE，×200)

更年期綜合征患者卵巢功能的衰退是由于卵巢老化、卵細胞過度耗竭所導致的。研究表明，體內自由基水平及其所誘發的脂質過氧化與衰老密切相關。其中，丙二醛(MDA)是重要的脂質過氧化物，是衰老的主要標志之一[12]。超氧化物歧化酶(SOD)能有效清除體內自由基和其代謝產物，是最主要的抗氧化酶之一[13-14]。實驗結果顯示，更年期模型大鼠血清中MDA水平提高，SOD活性下降，安神養血口服液能提高模型大鼠血清中SOD的活性，降低MDA水平，有效緩解衰老。

由下丘腦弓狀核與垂體中葉分泌的β-內啡肽(β-EP)，是一種內源性阿片肽，其通過抑制GnRH的釋放，進而影響單胺類神經遞質的生成和代謝，對穩定神經內分泌功能具有重要的意義。此外，研究發現，午后潮熱，烘熱汗出等更年期綜合征臨床表現也與β-EP水平下降息息相關[15]。實驗結果表明，安神養血口服液能夠提高內源性阿片肽β-EP的水平，更好地調節更年期綜合征模型大鼠的神經內分泌水平及改善相關癥狀。

綜上所述，安神養血口服液可以通過調節相關性激素以及單胺類神經遞質等的釋放，提高機體抗氧化酶的活性，加快體內脂質過氧化物的清除，起到改善更年期綜合征癥狀的作用。