丹皮酚對高糖誘導心肌細胞PI3K-Akt信號通路的影響

武單單， 周曉慧

(承德醫學院，河北 承德 067000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy)是指糖尿病患者排除高血壓和冠心病，單純由高血糖引起的心肌疾病。其病理特征主要表現為左心室的肥大和早期舒張功能的損害，伴隨心肌炎癥、心肌纖維化、心肌細胞凋亡，晚期可能伴有收縮功能障礙[1-2]。其心臟結構和功能的改變是糖尿病心肌病引起心力衰竭，發生死亡的主要因素之一[3]。在引起糖尿病心肌病的因素中，心肌細胞凋亡是糖尿病心肌病的重要發病環節。因此抑制心肌細胞凋亡可緩解糖尿病心肌病發生發展。丹皮酚又稱牡丹酚，是中藥牡丹皮(毛莨科植物牡丹的干燥根皮)和徐長卿(蘿藦科植物徐長卿的干燥根及根莖)的主要成分，丹皮酚是一種小分子酚類化合物，是一類天然活性物質，毒性極低?，F代藥理學研究表明丹皮酚具有廣泛的藥理作用，如抗氧化[4]、抗炎[5]、降血脂、降血糖[6]等，本課題組前期通過體內實驗已證實，丹皮酚對大鼠糖尿病心肌病起保護作用[7]。本實驗通過心肌細胞的原代培養，高糖刺激模擬臨床糖尿病患者體內高血糖的內環境，在細胞水平上探討丹皮酚防治糖尿病心肌病發揮作用的確切分子機制，為研發早期抑制糖尿病心肌病發生發展的新藥提供有價值的理論和實驗依據。

1 材料

1.1 動物 1～3 d新生SD乳鼠10～16只，雌雄不限，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物生產許可證號SCXK(京)2016-0006，本研究獲得承德醫學院動物倫理委員會批準(編號20190101)。

1.2 試劑與藥物 丹皮酚磺酸鈉注射液(金陵藥業股份有限公司南京金陵制藥廠，主要成分為丹皮酚磺酸鈉，輔料為依地酸二鈉、亞硫酸氫鈉、甘油，規格2 mL:0.1 g，批號180202)。胰酶、細胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、臺盼藍染色液(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；胎牛血清(美國Excell Bio公司，批號11I059)；5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxy uridine，BrdU)、噻唑藍(methylthiazolyldiphenyl-tet-razolium bromide，MTT)(美國Sigma公司)；AnncxinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(美國BD公司， 批號 556547)；細胞計數板(美國Thermo公司)；兔抗Akt(武漢愛博泰克生物科技有限公司，批號3515345201)；兔抗Bcl-2(美國Santa Cruze公司，批號k1918)；兔抗Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC(美國CST公司，批號2764、2772、9662、9661、11940)；兔抗 β-actin(北京博奧森生物技術有限公司)；辣根酶標記山羊抗兔IgG(北京義翹神州科技股份有限公司)。

1.3 儀器 超凈工作臺(上海博訊實業有限公司)；細胞培養箱(美國Thermo公司)；倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)；流式細胞儀[碧迪醫療器械(上海)有限公司]；200目細胞濾網(北京索萊寶科技有限公司)；CountessⅡ自動細胞計數儀(美國Life公司)；立式蒸汽高壓鍋(日本Tomy公司)；低溫高速離心機(澳大利亞Dynamica公司)；酶標儀(美國BioTek公司)；DYY-BC型電泳儀(北京市六一儀器廠)；全自動快速凝膠成像系統(美國Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 新生乳鼠原代心肌細胞的制備 取新出生1～3 d新生SD乳鼠，不分雌雄，用75%乙醇消毒3次后，置于超凈臺上，取心尖部分前，將乳鼠胸骨部分用75%乙醇進行第4次消毒，在劍突上一肋剪開胸骨，擠出心臟，用滅菌的眼科彎剪，剪去心臟前1/3的心室部分，放入盛有4 ℃預冷PBS液的1號培養皿中，再次用滅菌好的眼科彎鑷放入盛有4 ℃預冷PBS液的2號培養皿中，依次清洗，去掉血污。將清洗好的心肌組織用直剪和直鑷剪成0.5～1 mm3體積的小組織塊，用1號吸管將心肌組織吸入15 mL離心管中，用吸管將PBS吸出。用2號吸管吸取2 mL 0.25%胰蛋白酶清洗1 min，勻速搖晃離心管，將胰酶棄除。用2號吸管吸取2 mL 0.25%胰蛋白酶消化，勻速搖晃離心管，待觀察到胰酶渾濁后，吸出單細胞懸液，放入提前裝有30 mL 12%低糖DMEM培養基中終止消化。多次重復上一步，直至胰酶不再渾濁，且心肌組織由紅色變成透明狀的絮狀物。將收集到的所有心肌細胞，經200目細胞網篩過濾。將濾完的心肌細胞離心，1 500 r/min離心10 min，棄上清，加入新的培養基，吹打、混勻，接種于大皿中。將大皿放入5% CO2、37 ℃細胞培養箱中，用差速貼壁法培養細胞90 min。先貼壁的為成纖維細胞，未貼壁的心肌細胞懸液。按照心肌細胞懸液∶臺盼藍染液=9∶1的比例，將細胞密度調整為1×106/mL，并接種于6孔板中，并加入BrdU(0.1 mmol/L)以抑制成纖維細胞分裂增生。

2.2 MTT法篩選藥物質量濃度 實驗分為空白組(無細胞，只有培養液)、正常對照組(有細胞，葡萄糖濃度為5.5 mmol/L)、丹皮酚給藥組(25、30、35、40、45、50 μg/mL)，每組設置6個復孔，按照1×105/mL的密度接種在96孔板，每孔100 μL，放入5% CO2、37 ℃細胞培養箱中，加藥培養48 h后，每孔加入10 μL質量濃度為5 mg/mL的MTT，在培養箱中孵育4 h。將上清吸除以后，每孔中加入二甲基亞砜溶液150 μL，避光，室溫反應10 min。用酶標儀檢測每孔490 nm的吸光度(A)值。實驗重復3次，取均值。

2.3 高糖誘導心肌細胞損傷模型的制備 心肌細胞培養48 h后，用無FBS的高糖DMEM(35 mmol/L)培養基處理48 h。

2.4 實驗分組及給藥 將原代心肌細胞分離培養后的第3天，隨機分為以下5組，正常對照組加入不含FBS的低糖DMEM培養基；高糖組加入不含FBS、葡萄糖終濃度為35 mmol/L的DMEM培養基；丹皮酚低劑量組加入不含FBS、葡萄糖終濃度為35 mmol/L的DMEM培養基、終質量濃度10 μg/mL的丹皮酚；丹皮酚中劑量組加入不含FBS、葡萄糖終濃度為35 mmol/L的DMEM培養基、終質量濃度20 μg/mL的丹皮酚；丹皮酚高劑量組加入不含FBS、葡萄糖終濃度為35 mmol/L的DMEM培養基、終質量濃度40 μg/mL的丹皮酚。

2.5 流式細胞術檢測心肌細胞凋亡率 細胞凋亡檢測使用AnncxinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒，4 ℃預冷的PBS洗滌細胞2次，收集細胞后加入1×Binding Buffer重懸細胞，在加入AnncxinV-FITC混勻后，避光，室溫孵育15 min，上機前5 min再加入PI染色。

2.6 蛋白質免疫印跡(Western blot)檢測Akt、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC蛋白表達 實驗分為正常組(5.5 mmol/L)、高糖組(35 mmol/L)、丹皮酚低劑量組(10 μg/mL)、丹皮酚中劑量組(20 μg/mL)、丹皮酚高劑量組(40 μg/mL)。48 h后棄去原培養液，用PBS洗3遍，每孔加入50 μL裂解液(RIPA∶PMSF=100∶1)，冰上裂解30 min，4 ℃、13 500 r/min離心15 min，取上清液。BCA法進行蛋白濃度檢測，繪制出標準曲線，取總蛋白30 μg上樣。按4∶1混合蛋白液與5×Buffer上樣緩沖液，100 ℃ 孵育10 min至蛋白變性。10% SDS-PAGE穩壓電泳，冰中150 mA穩流轉膜，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜。次日孵育抗體，將膜放于1∶2 000一抗稀釋液中室溫搖床上孵育2 h，每次用TBST洗膜15 min，共洗3次；加入1∶8 000二抗稀釋液，室溫搖床上孵育90 min，每次用TBST洗膜10 min，共洗3次；顯影暗室中將ECL發光液滴加到載有蛋白的膜上，避光顯影。Image J分析條帶灰度值，以目的條帶灰度值/β-actin 灰度值表示蛋白表達。實驗重復3次，取均值。

3 結果

3.1 新生乳鼠原代心肌細胞形態學觀察 顯微鏡下觀察心肌細胞剛分離時呈圓形，折光性好，懸浮于培養基中，大概5～6 h后，開始貼壁生長，由圓形逐漸變成梭形；24 h后可見自發搏動，但節律和強度不同，伸出偽足，成梭形或多邊形，且胞核清晰；48 h后互相交織成網，形成細胞簇；72 h后收縮力明顯且搏動呈現同步性，心肌細胞增殖和分裂甚少。見圖1。

注：A為200倍，B為400倍。圖1 72 h不同倍數下心肌細胞形態學觀察

3.2 藥物篩選 丹皮酚終質量濃度為40 μg/mL時，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)，故以其為最大安全質量濃度。見表1。

3.3 心肌細胞凋亡率檢測 與正常組比較，高糖組細胞的凋亡率升高(P<0.01)；與高糖組比較，丹皮酚低、中、高劑量組細胞凋亡率降低(P<0.01)，其中丹皮酚中、高劑量組細胞凋亡率下降明顯(P<0.01)，見圖2、表2。

表1 丹皮酚安全用藥濃度篩選結果

圖2 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率

表2 各組細胞凋亡率比較

3.4 Akt、Bcl-2、Bcl-xL、Bax、caspase3、cleaved-caspase3、CytC蛋白表達檢測 與正常組比較，高糖組細胞Akt、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，Bax、cleaved-caspase3、CytC蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，caspase3蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與高糖組比較，丹皮酚低、中、高劑量組細胞Akt、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，Bax、cleaved-caspase3、CytC蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，呈一定的劑量依賴性；caspase3的蛋白表達在各用藥組中均無明顯變化(P>0.05)。見圖3～8。

注：與正常組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖3 心肌細胞Akt的蛋白表達

注：與正常組比較，*P<0.05；與高糖組比較，##P<0.01。圖5 心肌細胞Bcl-xL的蛋白表達

注：與正常組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖6 心肌細胞Bax的蛋白表達

注：與正常組比較，**P<0.01；與高糖組比較，##P<0.01。圖7 心肌細胞cleaved-caspase3 的蛋白表達

注：與正常組比較，**P<0.01；與高糖組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖8 心肌細胞CytC的蛋白表達

4 討論

糖尿病心肌病已經成為糖尿病致死的主要原因[8]。心肌細胞凋亡是重要發病環節。研究提示，高血糖可通過影響線粒體功能誘導程序性細胞死亡[9-10]。因此，抑制心肌細胞凋亡可減輕糖尿病心肌病對心肌組織的破壞。本研究經流式細胞術法檢測，結果顯示，與正常組比較，高糖組心肌細胞凋亡率升高(P<0.01)；與高糖組比較，丹皮酚各劑量組心肌細胞凋亡率降低(P<0.01)，且呈現一定的劑量依賴性，表明丹皮酚能夠通過抑制心肌細胞凋亡而對高糖損傷的心肌細胞產生保護作用。

高糖環境下，會產生大量的糖期終末化產物、聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶等激活細胞的凋亡機制，誘導細胞的異常凋亡。細胞凋亡包括凋亡抑制蛋白和凋亡誘導蛋白等多種蛋白聯合作用[11]。目前，多種因子被證明與心肌細胞的凋亡有關，其中Akt是其中之一[12]。以Akt基因敲除小鼠為研究對象，發現胰島素β細胞數目減少，且外周組織中出現了胰島素抵抗，早期出現心肌細胞的凋亡，導致2型糖尿病的發生[13-14]。在2型糖尿病胰島素嚴重抵抗的患者體內，也檢測出了Akt基因的突變，說明激活PI3K-Akt 信號通路將成為防治糖尿病心肌病心肌細胞凋亡的一個關鍵環節[13]。

線粒體凋亡通路是最主要的凋亡通路[14]，Bax在細胞質中以一種非活化的形式存在，在接收到凋亡信號后Bax移位到線粒體表面，破壞線粒體膜，增加線粒體通透性，致使細胞色素C外泄，線粒體凋亡途徑被激活，此凋亡途徑也可被Bcl-2、Bcl-xL等凋亡抑制蛋白所調控[15]，Bax與Bcl-2結合形成異源二聚體，可以阻止Bax向膜外移位，從而抑制其促凋亡的作用。caspase3作為凋亡的最終執行者，正常情況下以無活性的酶原形式存在，Akt一旦被激活發生凋亡級聯反應，caspase3被剪切活化為cleaved-caspase3，故抑制cleaved-caspase3的活化也能抑制細胞凋亡[16-18]。

本實驗經Western blot檢測，結果顯示，丹皮酚可抑制心肌細胞凋亡，增強Akt表達，激活PI3K-Akt信號通路，通過上調抗凋亡蛋白Akt、Bcl-2、Bcl-xL的表達，抑制促凋亡蛋白ERK1/2、p-ERK1/2、Bax、cleaved-caspase3、CytC的表達而實現，且呈現一定的劑量依賴性。

高糖環境下的心肌細胞，Akt激活障礙，PI3K-Akt信號通路傳導受限，致使促凋亡基因Bax、CtyC表達上調，抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表達受到抑制，誘導心肌細胞凋亡增強。經丹皮酚干預后，Akt表達增強，抑制了其下游促凋亡蛋白Bax、CtyC的表達，阻礙了caspase3的活化，同時促進抗凋亡基因Bcl-2、Bcl-xL表達，心肌細胞凋亡程度明顯減輕，使高糖損傷的心肌細胞得到了保護。

綜上所述，丹皮酚有效抑制高糖誘導的心肌細胞凋亡，可能是通過激活PI3K-Akt信號通路，促進抗凋亡基因蛋白的表達，抑制促凋亡基因蛋白表達，阻礙caspase-3的活化，顯著降低心肌細胞凋亡程度，從而保護高糖損傷的心肌細胞。