腎消通絡方對自發性糖尿病db/db小鼠腎臟炎性損傷及MCP-1、TNF-α水平的影響

楊秀芳， 白秀云， 丁英鈞,3*， 陳 亮， 蔡冀民， 常 奕

(1.河北中醫學院，河北 石家莊 050200；2.保定市第一中醫院，河北 保定 071000；3.河北省中西醫結合肝腎病證研究重點實驗室，河北 石家莊 050091；4.石家莊市中醫院，河北 石家莊 050051)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease, DKD)是由糖脂代謝紊亂導致的一種長期的慢性炎癥疾病，其病理改變主要由初期的腎小球肥大、基底膜的逐漸增厚以及細胞外基質的不斷沉積，逐漸發展為后期的腎小球硬化[1]。DKD又被認為是一種炎癥性疾病，其發生發展與炎癥反應密切相關[2-4]。炎癥信號通路TLR4/NF-κB和炎性因子MCP-1、TNF-α則被認為是參與DKD病情進展最為重要的因素[5-7]。糖尿病環境下，高表達的TLR4通過MyD88依賴途徑激活下游的核轉錄因子NF-κB，使腎臟的MCP-1、TNF-α呈高表達，從而誘發或加劇炎癥反應，使DKD病情進展加速[8]。

腎消通絡方是以通絡藥物為主的自擬方劑，有活血化瘀、益氣養陰之效。前期實驗表明腎消通絡方能夠降低尿蛋白，保護腎功能，有較好的抗炎、抗纖維化作用[9-10]，并且還能抑制血管新生和內皮細胞增殖，減輕腎臟病理改變[11]。本次實驗擬通過用腎消通絡方治療自發性糖尿病 db/db小鼠，觀察小鼠腎臟MCP-1、TNF-α表達的變化，進一步探討腎消通絡方改善db/db小鼠腎臟炎癥損傷的作用和潛在機制。

1 材料

1.1 動物 24只雄性自發性2型糖尿病db/db小鼠，7周齡，體質量(37±3) g；8只雄性同遺傳背景正常野生型db/m小鼠，7周齡，體質量(24±2)g，均購于南京大學模式動物研究所購入，動物生產許可證號SCXK(蘇)2018-0008，實驗期間自由飲水進食，環境溫度(24±3)℃。

1.2 試劑與藥物 腎消通絡方組方藥材黃芪、烏梢蛇、元參、黃連、地龍、蟬蛻、金雀根、地錦草、鬼箭羽、丹參、紅曲均購于河北樂仁堂國藥連鎖有限公司。嗎替麥考酚酯膠囊(批號SH2142，上海羅氏制藥有限公司)。TLR4多克隆抗體、MyD88多克隆抗體、NF-κB p65多克隆抗體、TNF-α多克隆抗體(美國Proteintech公司，生產批號分別為00048459、00056689、00057776、00077108)；MCP-1多克隆抗體(英國Abcam公司，批號GR1152-61)；MCP-1、TNF-α試劑盒(上海森雄科技實業有限公司，生產批號分別為SXM043、SXM063)。

1.3 儀器 電泳儀及電泳槽(美國Bio Rad公司)；化學發光成像儀(美國GE公司)；超低溫冰箱(日本Sanyo公司)；細胞破碎儀(美國Sonics公司)；高速冷凍離心機(美國Sigma公司)；電熱鼓風干燥箱(上海一恒科學儀器有限公司)；電熱恒溫水浴箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；冰箱(青島海爾集團股份有限公司)。

2 方法

2.1 分組與給藥 所有小鼠適應性喂養1周后隨機分為西藥組(db/db)、模型組(db/db)、中藥組(db/db)、正常組(db/m)，每組8只，給藥劑量參考《藥理與中藥藥理實驗》[12]，中藥組小鼠灌胃給予腎消通絡方水煎劑(26.8 g/kg)，西藥組小鼠灌胃給予嗎替麥考酚酯混懸液(0.3 g/kg)，模型組、正常組小鼠灌胃給予同體積1%羧甲基纖維素鈉溶液，每天1次，連續8周。

2.2 標本收集 小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘除眼球后收集血液，放入高速冷凍離心機中，4 ℃、10 000 r/min離心10 min，檢測血清MCP-1、TNF-α水平。處死小鼠，取出腎臟，剝離包膜，低溫保存，用于蛋白表達檢測。

2.3 指標檢測

2.3.1 血清MCP-1、TNF-α水平 采用酶聯免疫吸附法(ELISA)。在37 ℃下于酶標板孔中加入MCP-1、TNF-α對照品及樣品各100 μL，靜置90 min，加入稀釋的抗小鼠MCP-1、TNF-α抗體各100 μL，靜置60 min，加入親和素-過氧化物酶復合物工作液100 μL，靜置30 min，在避光條件下滴加100 μL TMB顯色液，待充分反應后加入50 μL TMB終止液，最后放到酶標儀中檢測MCP-1、TNF-α水平。

2.3.2 腎臟炎性因子和TLR4通路蛋白表達 采用Western blot法，稱取小鼠腎組織100 mg放至冰面上，按說明書加入4 μL蛋白酶抑制劑、400 μL裂解液，充分勻漿后靜置30 min，離心，取上清液，加5×上樣緩沖液，檢測蛋白濃度，制膠，上樣，90 V恒壓電泳，25 V恒壓轉膜，置于5%～10%脫脂牛奶中，常溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次8 min，再將PVDF膜放入一抗稀釋液中(稀釋比例依次為TLR4 1∶1 000、MyD88 1∶800、NF-κB p65 1∶1 000、MCP-1 1∶800、TNF-α 1∶800)，4 ℃過夜，次日將PVDF膜用TBST洗滌后放入二抗稀釋液中(稀釋比例為1∶10 000)，常溫封閉2 h，TBST洗滌3次，每次8 min，TBS洗滌8 min，避光條件下將PVDF膜放入ECL發光液中至完全浸透，迅速將膜放入化學發光成像分析儀中進行掃描分析，采用Image J軟件對蛋白條帶進行分析，以灰度值比值為目的蛋白表達量。

3 結果

3.1 血清MCP-1、TNF-α水平 模型組小鼠血清MCP-1、TNF-α水平高于正常組 (P<0.01)；西藥組、中藥組兩者水低于模型組 (P<0.01)，見表1。

表1 腎消通絡方對小鼠血清MCP-1、TNF-α水平的影響

3.2 腎臟炎性因子和TLR4通路蛋白表達 模型組小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κB p65表達及MCP-1、TNF-α水平高于正常組(P<0.01)；西藥組、中藥組上述因子表達和水平低于模型組(P<0.05，P<0.01)，見圖1、表2。

注：A為正常組，B為模型組，C為中藥組，D為西藥組。圖1 各組小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κBp65及MCP-1、TNF-α表達

表2 腎消通絡方對小鼠腎臟TLR4、MyD88、NF-κB及MCP-1、TNF-α表達的影響

4 討論

DKD的發生涉及許多方面，除既往研究較多的高血糖、遺傳、氧化應激等因素外[13-16]，炎癥被認為是促進腎臟損傷，導致DKD病情不斷進展的重要原因之一。炎癥信號通路TLR4/NF-κB以及炎癥因子在DKD的發病機制及進展中起著關鍵作用[17]。TLR4不僅分布在免疫細胞如巨噬細胞、淋巴細胞等表面，在腎臟系膜細胞、足細胞、上皮細胞等細胞表面也有大量表達。TLR4在糖尿病環境下，與腎組織表面的TLR4內源性配體結合而被激活。反過來，腎臟固有細胞、免疫細胞又能在TLR4的作用下被激活，分泌大量炎癥因子，誘導或加劇炎癥反應。同時，TLR4主要通過MyD88依賴途徑激活該信號通路，活化的TLR4與MyD88結合形成復合體，進一步使位于通路下游的核轉錄因子NF-κB被激活，從而產生大量的MCP-1、TNF-α[18]。高表達的MCP-1、TNF-α等炎癥因子又能激活NF-κB并促進單核巨噬細胞的浸潤和活化，使其產生更多的TNF-α、IL-6I、TGF-β、L-1β等炎癥因子，如此循環往復，使腎臟處于持續的炎癥狀態，縮短DKD發展為終末期腎病的時間[19]。

DKD是在陰虛為本燥熱為標的糖尿病病理基礎上不斷發展而來，日久氣陰兩虛，繼而陽氣受損，漸成陰陽兩虛之候。中醫認為“久病必虛”，正虛則邪實，機體無力鼓邪外出，導致病理產物如瘀血、痰飲、濕濁等不能及時被清除而瘀積，根據“久病入絡”“久病必瘀”的中醫理論，日久病邪就會深入腎絡，使腎絡瘀阻。而長期瘀積在腎絡的病邪屬陳積，非一般活血藥物能及，而蟲類藥物具有很強的走竄性，能夠深入腎絡搜剔瘀血，去除陳積，暢通絡脈，使邪去絡通，正氣得復，因此形成了以活血化瘀，益氣養陰為主要功效的腎消通絡方，方由黃芪、黃連、元參、蟬蛻、烏梢蛇、地龍、金雀根、紅曲、地錦草、丹參、鬼箭羽組成。該方含多種蟲類藥物，活血通絡之力較強，能直達病所，祛瘀生新，以通為補，標本兼顧，治療DKD療效顯著。

結果表明，經過8周藥物治療后，模型組小鼠腎臟和血清中MCP-1、TNF-α水平高于正常組小鼠，而西藥組和中藥組小鼠腎臟和血清中的MCP-1、TNF-α水平低于模型組，說明腎消通絡方能下調小鼠腎臟炎性因子的表達，減輕腎臟損傷。結果還發現，TLR4通路上的蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65在模型組中要高于正常組，而在西藥組和中藥組中又低于模型組。

綜上所述，腎消通絡方能下調小鼠腎臟炎性因子MCP-1、TNF-α的表達，改善治療組小鼠腎組織的炎性損傷，延緩病情進展，可能與腎消通絡方抑制炎癥通路TLR4/NF-κB p65的信號轉導有關。