廣防風體外抑菌活性及其穩定性研究

林大都， 張寬云， 張 瑩， 羅曉東， 張聲源*， 張魯斌

(1.嘉應學院，廣東 梅州 514031；2.嘉應學院，廣東省山區特色農業資源保護與精準利用重點實驗室，廣東 梅州 514031；3.廣州中醫藥大學青蒿研究中心，廣東 廣州 510405)

廣防風Anisomelesindica(L.) Kuntze為唇形科廣防風屬植物，又名防風草、土防風、抹草等[1]，民間以全草入藥，常用于治療皮膚濕疹[2]、瘙癢、癩瘡、毒蟲咬傷[3]，含有揮發油、生物堿、黃酮、降倍半萜、二萜、三萜、黃酮苷、苯乙醇苷類等化合物[4]，具有抗炎抗氧化、鎮痛、抗病毒等藥理活性[5-8]，但其抑菌活性鮮有報道。因此，本實驗采用K-B紙片法考察廣防風乙醇提取物、水提取物、不同極性部位對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、宋內志賀菌的抑制作用，微量肉湯稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)，瓊脂培養基平板法測定最低殺菌濃度(MBC)，并探討其抑菌穩定性的影響因素，以期為該藥材后期開發利用提供科學參考。

1 材料

1.1 儀器 BSC-1100ⅡA2超凈工作臺(濟南鑫貝西生物技術有限公司)；WGZ-XT細菌濁度儀(杭州齊威儀器有限公司)；FA7004電子天平(上海天美天平儀器有限公司)；DH-9162B電熱恒溫培養箱(上海一恒科學儀器有限公司)；WFH-203B三用紫外分析儀(上海精科實業有限公司)；PHSJ-4A實驗室PH計(上海精密科學儀器有限公司)；RT-6000酶標分析儀(深圳雷社生命科學股份有限公司)。

1.2 試劑與藥物 廣防風(地上部分)采自廣東省梅州市大埔縣高陂鎮五家輋村，經嘉應學院醫學院翟明講師鑒定為唇形科廣防風屬植物廣防風Anisomelesindica(L.) Kuntze，曬干后粉碎。95%乙醇(批號2006051)、石油醚(批號2008051)、乙酸乙酯(批號1901011)、正丁醇(批號2008051)、丙酮(批號2011021)、鹽酸(批號0804131)等為分析純，均購自西隴化工股份有限公司；氫氧化鈉(批號20170103)、氯化鉀(批號20180103)、氯化鐵(批號20180102)、氯化鈉(批號20180107)均購自天津市福晨化工試劑廠。普通瓊脂培養基(批號20180907)、肉湯液體培養基(批號20180903)均購自江門凱林貿易生物公司。

1.3 菌株 金黃色葡萄球菌(ATCC-25923)、枯草芽孢桿菌(ATCC-6633)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(ATCC-43300)、宋內志賀菌(ATCC-25931)、大腸埃希菌(ATCC-25922)、表皮葡萄球菌(ATCC-12228)均由嘉應學院醫學院微生物實驗室提供。

2 方法

2.1 供試液制備 取藥材粗粉80 g，加800 mL蒸餾水煎煮30 min，濾過，濾渣重復上述操作2次，合并濾液，減壓濃縮得到水提取物(6.5 g)。

另取藥材粗粉1 kg，加10 L 95%乙醇超聲提取30 min，抽濾得濾液，濾渣重復上述操作2次，合并濾液，減壓濃縮得到乙醇提取物(108.1 g)。取100.4 g，加適量蒸餾水超聲形成混懸液，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇各萃取3次，減壓濃縮，分別得到石油醚部位(13.6 g)、乙酸乙酯部位(5.5 g)、正丁醇部位(10.2 g)、水部位(59.1 g)。

將上述提取物及不同極性部位用50%丙酮超聲溶解，制成質量濃度為100 mg/mL(以提取物計)的藥液，0.22 μm濾膜過濾除菌，即得。

2.2 細菌培養及菌液配制 參考文獻[9]報道，將金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、宋內志賀菌從斜面培養基上挑出長勢良好者，置于無菌液體培養基中振搖均勻，在37 ℃培養箱中培養18～24 h，采用麥氏比濁儀測定菌懸液濃度，并調整為0.5麥氏點，細菌密度約為1×106～1×107cfu/mL。

2.3 抑菌活性測定 采用K-B法[10-11]，將無菌直徑為6 mm的濾紙片分別浸泡于“2.1”項下供試液及50%丙酮(對照)中30～60 min，取出晾干。取100 μL“2.2”項下菌懸液，注到瓊脂平板上，無菌棉簽涂布均勻，平鋪于平板中，以亞胺培南為陽性對照，室溫下靜置30 min后置于37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h，測定抑菌圈直徑，平行3次，取平均值。

2.4 MIC、MBC測定 采用微量肉湯稀釋法[12]測定MIC。取96孔微量板，第2～11孔加入100 μL肉湯液體培養基，第12孔加入肉湯液體培養基200 μL，留作不加藥液和菌液的正常生長對照。將100 μL藥液加至第1、2孔，吹打均勻后從第2孔轉移100 μL至第3孔吹打均勻，以此類推，依次遞倍稀釋，至第10孔吹打均勻后棄100 μL，第11孔作陰性對照。最后吸取100 μL菌懸液依次加入第1～11孔，振蕩混勻，置于37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h后觀察生長情況，以培養基澄清透明或無沉淀為無菌生長，無菌生長試驗孔中的最低生藥濃度即為MIC。

取上述96孔微量板，從每個無菌生長孔中吸取100 μL培養液至普通瓊脂培養基上，置于37 ℃恒溫培養箱中培養18～24 h，平均菌落數小于5個所對應孔的藥物濃度即為MBC[13]。

2.5 正丁醇部位抑菌穩定性評價

2.5.1 pH值 參考文獻[14]報道，用1 mol/L HCl或NaOH溶液分別調節100 mg/mL正丁醇供試液pH至1、3、5、7、9、11、13，以未經處理的供試液為對照，按“2.3”項下法測定抑菌活性。

2.5.2 紫外光照射時間 參考文獻[15]報道，將100 mg/mL正丁醇供試液在紫外光下照射5、10、15、20、25、30、60 min，以未經處理的正丁醇供試液為對照，按“2.3”項下法測定抑菌活性。

2.5.3 金屬離子種類 參考文獻[16]報道，在100 mg/mL正丁醇供試液中分別加入氯化鈉、氯化鉀和氯化鐵，配制成含0.05 mol/L Na+、K+、Fe3+的混合液，靜置3 h，以未經處理的正丁醇供試液作為對照，按“2.3”項下法測定抑菌活性。

3 結果

3.1 抑菌活性 圖1、表1顯示，乙醇提取物、水提取物、不同極性部位對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌均表現出不同程度的抑制作用，其中正丁醇部位最強；水提取物、水部位對枯草芽孢桿菌的抑制作用不明顯，而其他供試液均表現出一定活性，強弱依次為乙酸乙酯部位>石油醚部位>正丁醇部位>乙醇提取物；所有供試液對大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、宋內志賀菌均無明顯抑制作用。

注：a～g分別為乙醇提取物、水提取物、石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水層部位、亞胺培南。圖1 各供試液對供試菌的抑制作用

表1 各供試液對供試菌的抑菌圈直徑

3.2 MIC、MBC 表2顯示，乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的MIC在1.56～3.12 mg/mL之間，MBC為6.25 mg/mL，均優于水提取物，但對大腸埃希菌、表皮葡萄球菌和宋內志賀菌的抑制作用均不理想；正丁醇部位對金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其次是石油醚部位；正丁醇、石油醚部位對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的抑制作用最強，其次是乙酸乙酯部位；各供試液對枯草芽孢桿菌的抑制作用依次為乙酸乙酯部位>石油醚部位>正丁醇部位>水部位；各供試液對大腸埃希菌、表皮葡萄球菌、宋內志賀菌的抑制作用均不理想。

表2 各供試液MIC、MBC測定結果(mg/mL)

3.3 正丁醇部位抑菌穩定性(金黃色葡萄球菌)

3.3.1 pH值 圖2顯示，除pH為5外，pH為7、9、11、13時的抑菌圈直徑大于對照組(P<0.01)，為11時最強，并且抑制作用隨著其數值降低而有所下降，這可能是由于在酸性條件下正丁醇部位活性成分發生變化或與酸性成分發生反應而被破壞所致。因此，正丁醇部位在堿性條件下能更好地發揮作用。

注：與對照組比較，**P<0.01。圖2 pH對正丁醇部位抑菌穩定性的影響(n=3)

3.3.2 紫外光照射時間 圖3顯示，紫外光照射不同時間后對正丁醇部位的抑菌活性均無明顯影響(P>0.05)，表明抑菌活性成分對紫外光穩定。

圖3 紫外光照射時間對正丁醇部位抑菌穩定性的影響(n=3)

3.3.3 金屬離子種類 圖4顯示，在金屬離子存在的情況下正丁醇部位抑菌活性均受到不同程度的抑制(P<0.01)，其中Fe3+最明顯，其原因可能是金屬離子與活性成分發生反應所致。

注：與對照組比較，**P<0.01。圖4 金屬離子種類對正丁醇部位抑菌穩定性的影響(n=3)

4 討論

前期報道，從廣防風中分離得到的ovatodiolide具有明確的抗幽門螺桿菌活性，表明該藥材在抑菌方面具有一定的研究意義[17]。本實驗發現，廣防風乙醇提取物、水提取物、不同極性部位均對金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有一定的抑制作用，以正丁醇部位更明顯；除了水提取物和水部位外，各樣品對枯草芽孢桿菌也有效果。同時，穩定性試驗結果表明，紫外燈照射對廣防風正丁醇部位體外抑菌活性的影響較小，在堿性條件下能顯著提高其活性，而金屬離子的存在一定程度上抑制其活性，表明活性成分能與堿和金屬離子發生反應，導致活性增減影響。廣防風中酚酸、苯乙醇苷、黃酮苷是主要大極性成分[4]，均具有較強的抗菌活性[18-20]，這與其正丁醇部位表現出較強的體外抑菌活性有一定相關性。整體而言，廣防風在抑菌方面具有不錯的開發利用前景，后期可通過其他抑菌試驗來擴大其抗菌譜，尤其是對皮膚癬菌的抑制作用，并且其正丁醇部位可進行更深入的抑菌相關研究。