基于網絡藥理學探究紅花注射液治療原發性痛經的作用機制

戴淑穎， 邵田娛， 呂品秋， 錢燕娜， 張郜晨茜， 葉 平

(1.浙江中醫藥大學第一臨床醫學院，浙江 杭州 310053；2.浙江省立同德醫院生殖免疫科，浙江 杭州 310012)

原發性痛經在中醫中屬于“經行腹痛”的范圍，常見于青年婦女，指生殖器官無器質性病變，在行經前后或月經期出現下腹部疼痛、墜脹、伴腰酸或有其它不適者[1]。在原發性痛經的共識指南中，建議應用非甾體類抗炎藥和口服避孕藥作為一線治療[2]。但部分患者服用后會出現頭痛、嗜睡以及消化道反應等副作用，且不適用于備孕的人群。原發性痛經的中醫治療有獨特的優勢，中藥口服、外敷、針灸、推拿等療法的臨床療效均優于西藥治療，遠期療效明顯，且長期應用未發現副作用[3]。

紅花屬于菊科紅花屬的一年生草本雙子葉植物[4]，《本草綱目》記載其具有活血通經、散腫止痛的功效?，F代藥理研究表明，紅花中的活性成分如羥基紅花黃色素A、槲皮素等具有鎮痛、擴張冠狀動脈、改善心肌缺血、抗凝和抗血栓形成、抗腫瘤等功能[5]。紅花注射液是以紅花為主要原料、經科學提取精制而成的單一中藥注射液[6]，主要用于閉塞性心腦血管疾病、冠心病、脈管炎的治療。此外有臨床研究證明紅花注射液穴位注射治療原發性痛經有良好療效[7]，可能與紅花黃色素這一成分調節前列腺素系統有關[8]?，F關于紅花注射液治療原發性痛經的研究多局限于臨床，對其多成分多靶點治療原發性痛經的機制尚未能確切闡明，限制其廣泛應用。

近年網絡藥理學逐漸成為研究多成分中草藥的熱點，它基于藥效學、藥代動力學和系統級網絡分析，從蛋白質組學水平系統地揭示中草藥治療復雜疾病的多種機制[9]。本研究擬采用網絡藥理學的方法，借助TCMSP平臺[10]、CTD[11]、GeneCards[12]、PharmMapper[13]等疾病靶點數據庫搜集活性成分及候選作用靶點，通過cytoscape軟件[14]、GeneMANIA平臺[15]構建紅花注射液活性成分潛在靶點網絡、潛在靶點蛋白互作網絡(protein-protein interaction，PPI)以及核心靶點與臨近基因PPI來挖掘紅花注射液治療原發性痛經的核心靶點，利用ClueGO插件、R語言進行基因本體(GO)及KEGG富集分析，繼而在動物模型上驗證相關通路及靶點蛋白表達改變。

1 資料與方法

1.1 潛在活性成分及靶點篩選 首先利用TCMSP(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)平臺篩選出紅花的有效活性成分及其對應的靶點信息，參數設置按照簡化的里賓斯基五規則[相對分子質量(MW)<500、氫鍵供體(Hdon)≤5、氫鍵受體(Hacc)≤10、脂水分配系數(Alog P)<5.0、類藥比(DL)>0.18][16-17]。將活性成分利用反向對接服務器PharmMapper(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/)進行模擬分子-靶點對接，靶點范圍為“Human Protein Targets Only(v2010，2241)”，其余參數保持默認[18]。篩選標準為分子-靶點匹配度(fit score)，可反映配體構型與藥效團模型的疊合情況，選擇數值最高的10個靶點[19]。整合通過TCMSP平臺和反向對接搜集的靶點。在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中規范靶點名稱為屬于人(Homosapiens)的靶點基因名。

1.2 候選靶點蛋白互作網絡構建 以“dysmenorrhea”或“primary dysmenorrhea”等關鍵詞搜索CTD(http://ctdbase.org/)、GeneCards(https://auth.lifemapsc.com/)等數據庫，獲得與原發性痛經相關的基因。與上述靶點基因名進行匹配，其交集為候選作用靶點。通過String數據庫(https://string-db.org/，Version11.0)構建候選作用靶點蛋白互作網絡，調整“minimum required interaction score”保證可讀性，導出網絡數據。

1.3 “活性成分-靶點”網絡及靶點蛋白互作網絡構建 首先將網絡數據中基因靶點整合去重，在cytoscape軟件(version 3.7.1)中導入網絡數據文件中的node1、node2、combined score，利用其工具NetworkAnalyzer進行拓撲分析，篩選節點度值(degree)和介數中心度(betweenness centrality)大于等于所有點中位數值2倍，并滿足接近中心度(closeness centrality)大于所有點中位數值的靶點為紅花注射液治療原發性痛經的潛在靶點。再構建潛在靶點與對應紅花注射液活性成分的網絡圖，結合MCODE插件進行聚類分析，篩選核心靶標。然后采用GeneMANIA(http://www.genemania.org)平臺構建核心靶標與臨近基因的蛋白互作網絡，并進行功能富集分析。

1.4 GO、KEGG富集分析 采用RGUI及clusterProfiler對核心靶點進行GO富集分析，包括分子功能(molecular function，MF)、生物學過程(biologica process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)。再利用cytoscape的插件ClueGO、CluePedia對核心靶點進行KEGG富集分析，人工篩選富集網絡中的通路節點[20]。將候選作用靶點通過UniProt轉換為UniProtID，利用KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/kegg/pathway.html)中的“search&color pathway”工具把候選基因靶點映射到相關通路上。

1.5 動物實驗驗證

1.5.1 動物 SPF級雌性未孕SD大鼠15只，體質量180～220 g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，動物生產許可證號SCXK(滬)2012-0002，飼養于浙江中醫藥大學動物實驗研究中心，實驗前適應性飼養1周，晝夜時間各12 h，自由飲水、攝食，溫度(25±2)℃，相對濕度50%～60%。

1.5.2 試劑、藥物與儀器 紅花注射液(山西華衛藥業有限公司，批號16112912)；縮宮素(南京新百藥有業限公司，批號11801073)；補佳樂(戊酸雌二醇，德國拜耳公司，批號411A)。TNF-α、IL-6檢測試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司，批號EK382HS-24、EK306HS-24)；β-actin(杭州達文生物有限公司，批號DW9562)；PI3K、Akt、STAT3(美國Affinity Bioscience公司，批號AF6241、AF6261、AF6293)；p-Akt、EGFR、p-STAT3、MAPK(美國CST公司，批號4060S、4267S、9145S、4370S)；羊抗鼠、羊抗兔二抗(杭州達文生物有限公司，批號WD-0990、WD-GAR007)。多功能酶標儀(美國Thermo公司)；MP4+ChemidocXRS型蛋白印記檢測系統、Western blot套裝設備(美國Bio-Rad公司)。

1.5.3 建模與給藥 將15只大鼠隨機分為空白組、模型組、紅花注射液組各5只，通過雌激素和縮宮素聯合制備原發性痛經模型[21]?？瞻捉M大鼠每天灌胃給予等容積生理鹽水，模型組、紅花注射液組大鼠每天灌胃給予補佳樂(3 mg/kg)，連續12 d，以提高大鼠對縮宮素的敏感性，同時紅花注射液組大鼠腹腔注射紅花注射液(3 mL/kg)，空白組、模型組大鼠腹腔注射等容積生理鹽水。第12天給藥1 h后，模型組、紅花注射液組大鼠灌胃給予縮宮素2.5 U/只，造成原發性痛經模型。

1.5.4 指標檢測 第12天給予縮宮素后收集大鼠子宮組織，貯存于-80 ℃冰箱中，采用ELISA法檢測宮腔組織中炎癥因子水平，嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行。Western blot法檢測紅花成分-靶點-痛經KEGG富集分析核心通路中蛋白表達。裂解液提取大鼠子宮組織蛋白，測定其濃度，計算上樣量，以β-actin為內參調整上樣量，保證每個樣品孔的蛋白量一致，進行SDS-PAGE電泳，轉膜后封閉處理2 h，根據蛋白分子量切割PVDF膜，置入相應一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜后置入二抗(1∶10 000)，β-actin為羊抗鼠，其余蛋白為羊抗兔，室溫孵育2 h，蛋白印記檢測儀中曝光，采用Image Lab軟件進行灰度值分析，重復3次。

2 結果

2.1 活性成分及靶點 在TCMSP數據庫中搜索到紅花189種活性成分、1 466個靶點，按“1.1”項下方法篩選得到23種潛在活性成分及對應靶點，在PharmMapper數據庫中選取匹配度最高的10個靶點進行整合，刪去重復(389個)后共295個，見表1。在Uniprot數據庫中規范靶點為對應于人(Homosapiens)的靶點基因名，有1個靶點無法轉換。通過比對CTD、GeneCards數據庫中原發性痛經有關靶點，保留與其重疊的263個靶點作為候選靶點。

表1 紅花注射液潛在活性成分

2.2 核心靶點 在String數據庫中輸入上述候選靶點，設置“minimum required interaction score”為0.97，得到156個靶點參與的蛋白質互作網絡及數據。在cytoscape軟件中導入靶點和網絡數據中的“combined score”，用NetworkAnalyzer對得到的初始潛在靶點蛋白互作網絡分析，得到其節點度值、介數中心度、接近中心度的中位數分別為6、0.004 117 35、0.296 530 3，按“1.1”項下方法篩選，得到潛在靶點43個，見表2。在cytoscape軟件中另外構建潛在靶點(菱形)與對應紅花注射液活性成分(三角形)的網絡圖(圖1)，節點顏色深淺及邊的粗細分別代表代表degree值、combined score值。采用MCODE插件聚類分析，根據得分高低得到4個子網絡，選擇cluster 1中的13個靶點作為核心靶點，見圖2。將核心靶標輸入到GeneMANIA平臺，得核心靶標與臨近基因互作網絡及功能富集分析結果，見圖3。

圖1 “活性成分-潛在靶點”網絡圖

2.3 GO、KEEG富集分析

2.3.1 GO富集分析 將潛在靶點通過RGUI和clusterProfiler(p-value<0.05、q-value<0.05)進行分子功能(GO-MF)、生物過程(GO-BP)、細胞組分(GO-CC)富集分析，繪制條狀圖及氣泡圖，見圖4。

2.3.2 KEGG富集分析 將潛在靶點通過ClueGO、CluePedia進行KEGG通路富集分析(p-value<0.05，共111個條目)，選取富集結果中已有文獻報道與原發性痛經關系密切的PI3K/Akt及MAPK信號通路[22-23]，映射候選作用靶點，見圖5。

表2 紅花注射液活性成分潛在靶點

圖2 潛在靶點蛋白互作網絡(PPI)圖

圖3 核心靶標與臨近基因互作網絡圖

2.4 大鼠子宮組織腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)水平 與對照組比較，模型組大鼠子宮組織IL-6水平升高(P<0.05)；與模型組比較，紅花注射液組大鼠子宮組織TNF-α、IL-6水平降低(P<0.01)，見表3。

表3 各組大鼠子宮組織TNF-α、IL-6水平比較

2.5 大鼠子宮組織相關蛋白蛋白表達 與對照組比較，模型組大鼠子宮組織PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，紅花注射液組大鼠子宮組織PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高(P<0.01)。與對照組比較，模型組大鼠子宮組織MAPK、p-STAT3蛋白表達升高(P<0.05，P<0.01)，EGFR蛋白表達無明顯變化(P>0.05)；與模型組比較，紅花注射液組大鼠子宮組織MAPK、p-STAT3蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，EGFR蛋白表達無明顯變化(P>0.05)。見圖6。

圖4 GO富集分析

圖5 KEGG富集分析

3 討論

原發性痛經為婦女常見疾病，有報道稱其發病率為43%～90%，其中重度痛經約占18%，影響日常生活[24]?！秼D人良方大全》提到其主要證型為氣滯、血瘀等。而紅花有行氣化瘀之效，臨床療效。

基于上述實驗結果，共得出23個紅花注射液活性成分，其中黃芩素[25]、紅花黃色素[8]、芹黃素[26]、槲皮素[27-28]均有實驗研究證明對于原發性痛經起到治療作用。通過TCMSP數據庫、PharmMapper平臺、CTD數據庫和GeneCards數據庫，篩選出263個候選靶點。核心靶標與臨近基因PPI富集分析提示其主要參與調節細胞因子及炎癥反應。GO富集分析發現紅花注射液活性成分可能通過影響調控細胞周期、蛋白磷酸化過程、調節轉錄等生物學過程來達到治療原發性痛經的目的。根據KEGG富集分析結果，發現其可能調控PI3K/Akt、MAPK、EGFR/STAT3等多條信號通路發揮作用?，F代研究認為原發性痛經與前列腺素引起子宮高壓收縮、缺血以及月經周期中激素水平的變化有關[29]。PI3K-Akt信號通路主要調節細胞增殖和凋亡，當缺血缺氧、缺血再灌注等病理因素作用于細胞時，PI3K/Akt信號通路受到抑制并使其抗凋亡作用減弱[22]。EGFR/STAT3信號通路中，STAT3為急性相應期蛋白以及雌激素效應相關因子[30-31]，有動物實驗證明，p-STAT3高表達會導致雌激素過多合成，促進子宮內膜增殖、抑制正常細胞凋亡、增加侵襲性，導致子宮內膜異位癥的發生。有研究證明MAPK通路參與神經病理性疼痛的發生機制[23]，激活該通路會促使炎性因子、生長因子等高表達[32]。綜上，以上通路可能參與誘發原發性痛經。本研究通過構建大鼠原發性痛經模型來驗證上述結果。Western blot結果提示原發性痛經模型組子宮組織中PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達降低，MAPK、p-STAT3蛋白表達升高，可能加重原發性痛經，與其他類似研究結果一致。經過紅花注射液治療后，子宮組織中PI3K、p-PI3K、p-Akt蛋白表達升高，MAPK、p-STAT3蛋白表達降低，提示紅花注射液可通過調控PI3K/Akt、MAPK、EGFR/STAT3等多條信號通路緩解原發性痛經。根據“活性成分-潛在靶點”的網絡信息以及查閱相關文獻，核心靶點中的炎癥因子TNF-α和IL-6可以刺激絨毛膜的花生四烯酸代謝，后者生成前列腺素類、血栓烷類和白三烯類，從而導致原發性痛經[33]。ELISA結果示模型組大鼠子宮組織中IL-6水平較對照組升高，說明IL-6水平升高是加重原發性痛經的因素之一；紅花注射液治療后，子宮組織中TNF-α、IL-6水平較模型組降低，提示紅花注射液可減輕子宮炎癥緩解疼痛。

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。圖6 各組大鼠子宮組織相關蛋白表達

本研究通過網絡藥理學的方法，對紅花注射液中的活性成分治療原發性痛經的機制進行探究。紅花注射液中的23個潛在活性成分通過調節多個靶點作用于不同通路，提示其多成分多靶點多通路的作用特點，體現了中草藥治病的客觀優勢。本研究發現紅花注射液可能通過以下3個方面發揮治療原發性痛經的作用，①通過激活子宮PI3K/Akt信號通路，促進PI3K、Akt磷酸化，恢復抗凋亡作用，改善子宮缺血缺氧環境；②通過下調EGFR/STAT3信號通路，調控雌激素效應，改善子宮環境；③通過下調MAPK信號通路，降低炎癥因子TNF-α、IL-6的表達，抑制子宮炎癥反應。

本研究仍有以下不足，首先活性化合物的搜集僅利用TCMSP平臺，較為單一，其次分析所得的通路在原發性痛經中已有相關研究，潛在活性成分及靶點與已有文獻較為接近，雖然可以表明基于網絡藥理學的方式探討紅花注射液的作用機制具有一定準確性，但缺乏創新性。本研究的結論仍需要進一步驗證，為紅花注射液開發應用提供了參考。