基于網絡藥理學與分子對接探究復方魚腥草合劑抗COVID-19的作用機制

劉玉萍， 屠書梅， 陳 彥*

(1.南京中醫藥大學附屬中西醫結合醫院，江蘇 南京 210028；2.江蘇省中醫藥研究院中藥組分與微生態研究中心，江蘇 南京 210028；3.江蘇大學藥學院，江蘇 鎮江 212013)

以病毒為病原體的病毒性肺炎，不僅具有廣泛的傳播性，還可導致嚴重的呼吸系統疾病如嚴重急性呼吸系統綜合征(SARS)、中東呼吸系統綜合征(MERS)等，嚴重者導致死亡[1]。2019年新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情爆發，對人們健康造成了極大損害。中醫認為，本病屬“疫病”范疇，患者感受疫戾之氣，病位在肺，以“濕、熱、毒、瘀”為基本病機[2]。國家衛生健康委員會陸續發布更新的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》顯示，中醫藥治療在方案中發揮了重要作用[3]。

復方魚腥草合劑由魚腥草、黃芩、板藍根、連翹、金銀花5味藥材組成，方中以魚腥草為君藥，具有清熱解毒、利尿除濕、清熱止痢的功效；黃芩為臣藥，具有清熱燥濕、瀉火解毒之功；佐藥板藍根具有清熱解毒、涼血利咽功效，連翹具有清熱解毒、消腫散結功效；金銀花具有清熱解毒、疏散風熱功效，常用于治療外感風熱引起的咽喉疼痛、急性咽炎、扁桃腺炎有風熱證候者，臨床上防治肺炎具有顯著的療效[4]，但是否對COVID-19有效及其可能機制尚不清楚。

網絡藥理學能幫助研究者揭示中藥復方的配伍規律，分析中藥復方的潛在蛋白靶點，為中藥尋找新的適應癥[5]。本研究擬通過網絡藥理學，收集復方魚腥草合劑的可能有效成分及靶標，構建并分析復方魚腥草合劑的“成分-靶標”網絡，并對有效成分與新型冠狀肺炎發病機制相關蛋白進行計算機虛擬預測，為復方魚腥草合劑的治療新型冠狀病毒肺炎的臨床應用研究提供理論和實驗基礎。

1 資料與方法

1.1 成分收集 在TCMSP數據庫平臺(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)[6]檢索框中輸入5味組方藥材名，收集所有相關成分，分別為魚腥草50種、黃芩143種、板藍根169種、連翹150種、金銀花236種，其中82種為共有成分，最終得到662種。

1.2 活性成分確定 將TCMSP數據庫平臺提供的毒藥物動力學(ADME)特性模型與文獻確認的方式相結合，篩考慮到復方魚腥草合劑的給藥方式為口服給藥，故選擇口服生物利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18、Caco-2滲透性(Caco-2)≥-0.4、藥物半衰期(HL)≥4作為篩選條件，收集符合條件的化學成分作為成分集[7]。

1.3 靶標蛋白基因名確定及成分-靶標網絡構建 在TCMSP數據庫平臺(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php)中收集成分對應的蛋白名，借助UniProt(https://www.uniprot.org/)等數據庫查詢靶標蛋白對應基因名，采用Cytoscape 3.6.1軟件構建成分-靶點網絡，分析化合物和靶點網絡。

1.4 富集分析 采用基于DAVID的可視化、可注釋、可集成發現商業數據庫(QuickGO)，從生物學過程(BP)、細胞成分(CC)、分子功能(MF)3個方面對靶標進行基因本體(GO)分析，將篩選得到的作用靶標DAVID數據庫輸入靶標的基因名列表，并限制物種為人源，勾選official gene symbol矯正基因名稱，設定P<0.05，進行GO富集、KEGG通路分析。

1.5 成分-靶標分子對接 下載化合物的*mol格式文件，采用Chem Office軟件將化合物結構保存為*mol2格式，再經加氫、賦予力場后保存為SD格式。3CLpro、Spike蛋白下載于PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)，PDB ID分別為6LU7、6VSB，而ACE2來源于文章報道doi.org/10.1101/2020.02.19.956946，蛋白經加氫、準備、賦予力場后，定義3CLpro的原抑制位點為活性位點，Spike和ACE2的相互作用表面為活性位點，采用Discovery studio 3.5平臺的CDocker模塊進行對接。

2 結果

2.1 活性成分篩選 在“1.2”項篩選條件下，共收集了77種潛在活性成分(圖1A)，進一步分析發現，約有47.28%的分子(313/662)具有口服生物利用度，但只有37.01%(245/662)具有較長的半衰期；約有75.22%(498/662)易于被Caco-2細胞單層吸收，48.94%(324/662)具有成藥性(圖1B)，去掉重復數據，共收集到有77種具有詳細ADME參數和結構信息的成分，見表1。其中，MOL000422(山柰酚)、MOL000098(槲皮素)是魚腥草、連翹、金銀花共有成分；MOL001689(金合歡素)、MOL000359(谷甾醇)是黃芩、板藍根的共有成分；MOL000173(漢黃芩素)是黃芩、連翹共有成分；MOL002914(eriodyctiol flavanone)是黃芩、金銀花共有成分；MOL000358(β-谷甾醇)是黃芩、板藍根、連翹、金銀花共有成分；MOL000449(豆甾醇)是黃芩、板藍根、金銀花共有成分；MOL000006(木犀草素)是連翹、金銀花共有成分，見圖1C、表2。

2.2 靶標收集 共收集到248個相應靶標，分別為魚腥草218個、黃芩123個、板藍根87個、連翹219個、金銀花218個。

2.3 成分-靶標網絡構建 中藥復方通常具有多種藥理作用，其成分可能作用于多個不同的靶標[8]。本研究構建的成分-靶標網絡(圖2)包含315個節點、1 062個復合目標交互，但僅顯示67種成分，這是因為另外10種成分數據庫中報告為無人源性靶標或未報道相關靶標。由此可知，分子MOL000098-槲皮素對應靶標最多(148個)，其次是MOL000422-山柰酚(62個)、MOL000006-木犀草素(57個)、MOL000173-漢黃芩素(44個)、MOL002714-黃芩素(37個)，可能是復方魚腥草合劑重要活性物質，例如槲皮素、木犀草素、山柰酚分別是魚腥草、金銀花、連翹主要成分，具有抗炎、抗氧化活性，被廣泛用于臨床治療肺炎[9-11]；前列腺素G/H合酶2(PTGS2)的潛在配體數量最多(53個)，其次是前列腺素G/H合酶1(PTGS1，49個)、熱休克蛋白90(HSP90，45個)。

圖1 復方魚腥草合劑活性成分分布

表1 復方魚腥草合劑活性成分

續表1

表2 不同中藥中的共有成分

2.4 GO富集、KEGG通路分析P<0.05的GO條目共115個，包括BP條目82個，CC條目16個，MF條目17個，分別占比71%、14%、15%，大多與免疫、炎癥、細胞過程等有關，排名前20者見圖3。

圖2 成分-靶標網絡圖

圖3 GO富集分析

P<0.05的KEGG通路共99條，包括HTLV-I infection、epstein-barr virus infection、influenza A、herpes simplex infection、viral carcinogenesis、prion diseases等與病毒感染有關的通路，pertussis(百日咳)、tuberculosis(肺結核)、non-small cell lung cancer、small cell lung cancer等與咳嗽、肺部疾病相關的通路，PI3K-Akt signaling pathway、T cell receptor signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、TNF signaling pathway、B cell receptor signaling pathway、toll-like receptor signaling pathway、chemokine signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、cytokine-cytokine receptor interaction等與炎癥、免疫系統密切相關的信號通路，排名前20者見圖4。

圖4 KEGG富集分析

2.5 分子對接 目前，對治療COVID-19藥物靶標的研究主要集中在受體蛋白如血管緊張素酶2(AEC2)、病毒S蛋白(主要是S1蛋白)、病毒復制相關蛋白[如3-胰凝乳樣蛋白酶(3CLpro)]等[12-13]。本研究以用排名前4的成分(MOL000422-山柰酚、MOL000006-木犀草素、MOL000173-漢黃芩素、MOL002714-黃芩素)為配體，與AEC2、S蛋白、3CLpro蛋白進行虛擬分子對接，結果見圖5、表3。由此可知，這4種成分與上述蛋白均有一定結合能力，并且整體上與3Clpro蛋白原抑制位點的結合鍵能最低，即結合能力最強。

3 討論

本研究通過網絡藥理學，充分利用TCMSP數據庫，收集復方魚腥草合劑已報道的活性成分，充分考慮藥物的口服吸收及成藥潛力，依據化合物OB、Caco-2、HL、DL值，對復方魚腥草合劑中進行有效成分的篩選，最終獲得77種可能活性成分。進一步對這些活性成分進行預測靶標的收集，基于此繪制并得到了龐大的“成分-靶標”網絡圖(圖2)，每種成分都有對應一個或多個靶標，而每個靶標也都有對應的一種或多種成分，說明中藥作用多成分、多靶標、相互協同的作用特點。

對復方魚腥草合劑成分的靶標進行GO富集分析，得到與炎癥、免疫應答相關的多個生物學過程；KEGG富集分析得到與抗病毒、治療肺部疾病、炎癥相關的多個通路(圖4)。文獻報道，黃芩、板藍根、金銀花、連翹等具有直接對抗病毒的作用；魚腥草則具有緩解咽痛、咳嗽等急性上呼吸道感染的癥狀；而金銀花、連翹等中藥多具有抗炎、抗氧化的作用。因此，經通路分析，本研究認為復方魚腥草合劑可以通過調節多條信號通路治療病毒性肺炎。除此之外，在KEGG富集的結果中，本研究還發現了與胰島素抵抗等糖尿病相關的生物學過程，從本次新型冠狀肺炎從報道來看，合并存在某些基礎疾病如糖尿病、心腦血管疾病等的中老年人易感[14]。查閱文獻發現，魚腥草可通過抗炎等作用途徑改善糖尿病小鼠的腎損傷，減輕糖尿病慢性并發癥[15]。因此，本研究認為復方魚腥草合劑可能有治療新型冠狀病毒性肺炎的潛力，并且可能對具有基礎疾病如糖尿病的患者治療起到一定作用。

圖5 核心成分與3種蛋白對接的三維模式圖

表3 核心成分與3種蛋白的結合鍵能量打分

研究表明，新型冠狀病毒COVID-19通過其S蛋白上的受體結合域(RBD)與ACE2相結合進入細胞。目前研究表明抗瘧藥物磷酸氯喹通過干擾ACE2受體的糖基化，抑制病毒與細胞的結合，因而被納入治療方案[16]。然而，因其劑量使用大，用藥周期長，易導致相關的不良反應，引起了眾多學者的注意，更多安全有效的ACE2抑制劑還在進行篩選和研制[17]。病毒的復制和組裝過程是病毒成功感染的關鍵過程，參與這一過程的蛋白成為抗病毒藥物研發的另一個策略。其中，3-胰凝乳樣蛋白酶(3CLpro)通過參與多肽翻譯參與病毒的復制，成為藥物研發的靶標。洛匹那韋是3CLpro抑制劑，已應用于新冠肺炎的治療與臨床試驗，然而部分學者認為其效果不佳且具有毒副作用[18]。總體來說，尚無具有針對性的特效藥，且針對單一靶標的藥物療效不穩定且易產生不良反應。基于KEGG富集分析結果，復方魚腥草合劑具有較好的抗病毒能力。計算機虛擬對接結果顯示復方魚腥草合劑的核心成分與目前3類研發治療新冠病毒肺炎的潛在藥物靶點ACE2、S蛋白、3CLpro蛋白的對接情況普遍良好，且與3CLpro的對接能力最佳，本研究可以推測復方魚腥草合劑組方藥材的存在具有抗COVID-19作用有效成分，其抗病毒機制可能更傾向于抑制病毒的復制過程。

綜上所述，本研究借助網絡藥理學構建“成分-靶標”網絡及計算機虛擬結合技術，初步探索了復方魚腥草合劑治療新型冠狀病毒肺炎的可能性和生物學途徑，分析了核心有效成分的潛在作用機制。還有很多問題需要進一步思考和解決。首先，基于數據挖掘及篩選得到的有效成分與復方魚腥草合劑最終制劑中的有效成分是否有差別，需要進一步采用分析的手段如質譜等進一步鑒別；其次，本文僅考慮構建了“成分-靶標網絡”，新型冠狀病毒肺炎引起的呼吸系統甚至是全身器官的損害是復雜的，處于不同發病時期的狀態和發病機制也不盡相同，需要進一步構建病毒性肺炎疾病網絡，針對性的預測復方魚腥草合劑的臨床試用范圍。最后，相關的結果都需要進行進一步的臨床和實驗驗證。