基于“味性化味-網(wǎng)絡(luò)藥理-分子對(duì)接”的藏藥四味姜黃湯防治糖尿病腎病的作用機(jī)制預(yù)測(cè)

仁增加， 李啟恩,2*， 切羊讓忠， 彭毛東主,3， 貢卻堅(jiān)贊,2*

(1.青海大學(xué)藏醫(yī)學(xué)院，青海 西寧 810000；2.藏藥新藥開發(fā)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016；3.青海省藏醫(yī)院，青海 西寧 810016)

糖尿病腎病是糖尿病血糖控制不良引起的一種最常見的微血管并發(fā)癥, 也是糖尿病患者的主要致死原因[1]。目前在中國已有9 200萬糖尿病患者, 1.48億糖尿病前期患者[2]，糖尿病腎病的患病率也隨糖尿病患者的增加而提高，故早期對(duì)糖尿病腎病進(jìn)行防治極為重要。藏醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病屬于“京尼薩庫”病的范疇，始載于八世紀(jì)的藏醫(yī)藥經(jīng)典著作《四部醫(yī)典》，是由于偏攝咸、酸和甘味及性寒、重的飲食及久居濕寒之地，致使藏醫(yī)“三因”中的“培根”偏盛和七精之“脂肪”過剩，導(dǎo)致精華不化而隨糟粕經(jīng)腎臟和膀胱排出體外，致使主司消化和吸收的藏醫(yī)“三火”衰弱而引發(fā)腎臟受損的一種疾病。

藏藥四味姜黃湯是藏醫(yī)治療“京尼薩庫”病的代表性方劑，始載于《四部醫(yī)典》，由姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜四味藥材組成[3]，被收錄于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥》[4]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)藏藥四味姜黃湯能有效拮抗VEGF的活性和對(duì)抗腎小球基底膜增厚，對(duì)糖尿病腎病大鼠腎損傷有保護(hù)作用[5]，為治療糖尿病腎病提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但四味姜黃湯治療糖尿病腎病的眾多機(jī)制及活性成分尚不清楚。鑒于此，本研究基于藏藥藥性理論和系統(tǒng)生物學(xué)理論，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)方法，揭示藏藥四味姜黃湯治療糖尿病腎病的主要活性成分及作用機(jī)制，為后續(xù)研究提供參考[6]。

1 材料與方法

1.1 挖掘四味姜黃湯主治疾病的分布情況及“味性化味”分析 收集2018年6月3日至2019年3月3日的青海省藏醫(yī)院國醫(yī)大師尼瑪門診病歷中四味姜黃湯主治疾病信息，分析其治療疾病分布情況，利用藏藥“味性化味”理論和Cytoscape軟件構(gòu)建藏藥味-化味-效-性-“三因”的網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2 四味姜黃湯的化合物及成分篩選 本文通過采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺(tái)TCMSP (http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，以口服生物利用度(oralbioavailability，OB)≥30%和類藥性(drug-like，DL)≥0.18作為篩選條件[7-8]，結(jié)合諸多藥理及化學(xué)成分研究的文獻(xiàn)分析，查找并獲取姜黃、小檗皮、余甘子、蒺藜等四味藏藥材中符合要求的化合物。

1.3 化合物靶點(diǎn)的獲取 根據(jù)篩選出來的化合物在Pubchem數(shù)據(jù)庫中查找其Canonical SMILES結(jié)構(gòu)，上傳至Swiss TargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)、STITCH(http://stitch.embl.de/)數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)信息，并進(jìn)一步在UniProt數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因注釋及確認(rèn)，利用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 交集基因的收集和藥物-成分-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 以diabetic nephropathy為檢索詞，在人類基因數(shù)據(jù)庫Genecards(https://www.genecards.org/)和人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫OMIM(https://omim.org/)檢索與糖尿病腎病相關(guān)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行整合和去重處理，獲取四味姜黃湯與糖尿病腎病的交集基因，并進(jìn)一步構(gòu)建藥物-成分-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)的構(gòu)建與分析 將交集靶點(diǎn)上傳至String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，物種選為Homosapiens，評(píng)分條件設(shè)定為0.4，利用Cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 GO功能和KEGG通路富集分析 將關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入人類基因組注釋數(shù)據(jù)庫DAVID ver.6.8(https：//david.ncifcrf.gov/)，進(jìn)行基因本位論(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集分析，設(shè)定閾值P<0.05[9]，篩選GO富集中每個(gè)組分P值排名前5和KEGG通路分析前20的結(jié)果，并應(yīng)用KEGG mapper工具構(gòu)建主要信號(hào)通路的通路圖。

1.7 分子對(duì)接 應(yīng)用Pubchem數(shù)據(jù)庫下載活性成分的3D結(jié)構(gòu)并以mol2格式保存，從PBD數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)下載核心靶標(biāo)的PDB格式文件。運(yùn)用分子對(duì)接軟件對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行預(yù)處理，進(jìn)行蛋白質(zhì)氨基酸殘基的修復(fù)、Protonate 3D加氫加電荷操作、設(shè)置力場(chǎng)參數(shù)、刪除水分子、能量最小化，之后對(duì)配體進(jìn)行能量最小化操作，最后選擇基于蛋白和配體間相互作用能的打分函數(shù)ASE，分別得到每個(gè)化合物與受體的對(duì)接打分值，打分值越低，配體與受體結(jié)合越穩(wěn)定。

2 結(jié)果

2.1 分析疾病分布情況及構(gòu)建 “味性化味”網(wǎng)絡(luò)圖 從收集得到的320例臨床數(shù)據(jù)分析得出，四味姜黃湯的主治疾病中藏醫(yī)“京尼薩庫”病(糖尿病)的頻次最高(84次)(表1)，此外，“查隆”病(相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的血液循環(huán)系統(tǒng)疾病如微循環(huán)障礙性疾病和血壓異常性疾病)、“培查”病(相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的高脂血癥及代謝性疾病)和腎熱病(相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)的輕度腎炎)的治療頻次也很高，分別出現(xiàn)了24、17次和14次。根據(jù)四味姜黃湯的 “味”和“化味”、劑量比值[3]構(gòu)建作用于京尼薩庫的網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)，結(jié)果顯示，四味姜黃湯方劑的味性特癥為六味中以甘、澀為主，三化味中以苦化味為主，十七效中以重(21.32)、鈍(19.7)、穩(wěn)(15.15)、干(14.01)、潤(13.15)、輕(12.41)和涼(12)為主，通過干預(yù)疾病的熱(29.9)、銳(21.1)、臭(17)、動(dòng)(13.15)、重(9.61)等藥性，起到以清“赤巴”為主(61.51)、調(diào)和“隆”為關(guān)鍵(58.62)、息“培根”為基礎(chǔ)(41.24)的治療目的。

表1 四味姜黃湯主治疾病的分布情況(頻次>9)

圖1 藥物-味化味-效-特性-三因網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 篩選四味姜黃湯的化合物 通過分析文獻(xiàn)及TCMSP、Pubchem、Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫為根據(jù)，確定了四味姜黃湯的21個(gè)活性成分(山柰酚為小檗皮和蒺藜共同化合物)，將整理好的化合物分別上傳至Pubchem數(shù)據(jù)庫獲取分子式、Canonical SMILES、CAS號(hào)等信息(表2)。

2.3 作用靶點(diǎn)的篩選 將化合物的Canonical SMILE結(jié)構(gòu)逐一上傳至Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取靶點(diǎn)，進(jìn)一步使用Uniport數(shù)據(jù)庫對(duì)其進(jìn)行矯正統(tǒng)一和去重處理，得到靶點(diǎn)分別為姜黃50個(gè)、小檗皮48個(gè)、余甘子99個(gè)、蒺藜58個(gè)。使用Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖(圖2)和計(jì)算相關(guān)網(wǎng)絡(luò)屬性，圖中內(nèi)圈表示度值≥5的基因，其余是度值<5的基因。該網(wǎng)絡(luò)由159個(gè)節(jié)點(diǎn)和468個(gè)邊構(gòu)成，化合物中與20個(gè)以上靶點(diǎn)相連的有13個(gè)，其中與活性成分山柰酚相連接的靶點(diǎn)高達(dá)46個(gè)，與10個(gè)以上化合物相互作用的靶點(diǎn)有BACE1、ESR2、ACHE、ESR1、ALOX5、GSK3B等。

表2 四味姜黃湯的化合物信息

圖2 四味姜黃湯的化合物-靶點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 交集基因的收集和藥物-成分-基因-疾病網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Genecards和OMIM數(shù)據(jù)庫檢索與糖尿病腎病有關(guān)的所有靶點(diǎn)，并計(jì)算與糖尿病腎病的交集基因，其中姜黃與糖尿病腎病的交集基因23個(gè)，小檗皮與糖尿病腎病的交集基因27個(gè)，余甘子與糖尿病腎病的交集基因53個(gè)，蒺藜與糖尿病腎病的交集基因31個(gè)，去重處理后得交集基因68個(gè)，并利用Cytoscape軟件構(gòu)建了四味姜黃湯防治糖尿病腎病的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖，見圖3，該網(wǎng)絡(luò)由93個(gè)節(jié)點(diǎn)和352條邊構(gòu)成，平均度值為7.56。

圖3 四味姜黃湯散的藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 四味姜黃湯PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 將68個(gè)交集基因上傳至String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建作用靶點(diǎn)互作網(wǎng)絡(luò)，見圖4，此網(wǎng)絡(luò)中的交集靶點(diǎn)相互作用產(chǎn)生了290條蛋白互作的邊，度值≥13的有15個(gè)核心基因，見圖5，其中VEGFA(38)、CASP3(35)、HSP90AA1(34)、ESR1(26)、MTOR(24)的度值較高，推測(cè)這些靶點(diǎn)可能是防治糖尿病腎病的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

圖5 四味姜黃湯散PPI核心基因柱狀圖

2.6 四味姜黃湯GO生物功能和KEGG通路富集分析 GO功能分析結(jié)果顯示四味姜黃湯參與28個(gè)生物過程、8個(gè)細(xì)胞組分、12個(gè)分子功能，根據(jù)P值分別列出了GO富集分析中排名前5的結(jié)果(圖6)，主要涉及的生物過程有Positive regulation of phospholipase C activity (4個(gè)靶點(diǎn))、Transcription, DNA-templated(7個(gè)靶點(diǎn))、Positive regulation of protein kinase B signaling(4個(gè)靶點(diǎn))、Protein autophosphorylation(5個(gè)靶點(diǎn))、positive regulation of MAP kinase activity(3個(gè)靶點(diǎn))。涉及的細(xì)胞組分有Endosome(5個(gè)靶點(diǎn))、Cytosol(10個(gè)靶點(diǎn))、Nucleus(16個(gè)靶點(diǎn))、Extracellular space(7個(gè)靶點(diǎn))、Intrinsic component of plasma membrane(2個(gè)靶點(diǎn))。涉及的分子功能有ATP binding(17個(gè)靶點(diǎn))、Protein serine/threonine kinase activity(7個(gè)靶點(diǎn))、Cyclin-dependent protein serine/threonine kinase activity(3個(gè)靶點(diǎn))、Steroid binding(3個(gè)靶點(diǎn))、Sequence-specific DNA binding(6個(gè)靶點(diǎn))。表明四味姜黃湯參與體內(nèi)多種生物學(xué)調(diào)控過程以發(fā)揮防治糖尿病腎病的作用。

圖6 交集基因GO富集條形圖分析

KEGG通路分析結(jié)果顯示，四味姜黃湯的交集基因共涉及45條信號(hào)通路過程，根據(jù)P值列出了排名前20的通路(見圖7)，分別有PI3K-Akt信號(hào)通路、黏附、癌癥相關(guān)通路、MAPK信號(hào)通路、細(xì)胞骨架、AGE-RAGE信號(hào)通路和P53信號(hào)通路等。選擇主要信號(hào)通路PI3K-Akt(15個(gè)靶點(diǎn))繪制通路圖，見圖8。

圖7 四味姜黃湯活性成分通路富集分析氣泡圖

2.7 活性成分和核心靶標(biāo)分子對(duì)接預(yù)測(cè) 如表3、圖9所示，化合物谷甾醇、豆甾醇、余甘根苷A和蛋白VEGFA, 化合物谷甾醇和蛋白CASP3均有較好的結(jié)合活性，對(duì)接分值分別為-33.047、-31.554、-29.729、-29.929。從2D和3D對(duì)接圖可見，上述四個(gè)化合物與蛋白VEGFA、CASP3結(jié)合至少形成了一個(gè)氫鍵相互作用力，如化合物谷甾醇與VEGFA中的Gly922形成了1個(gè)氫鍵，化合物余甘根苷A與VEGFA中的Glu885、leu840、Val899形成了3個(gè)氫鍵，與Cys919形成π-H共軛，正是因?yàn)檫@些氫鍵的π-H共軛鍵的存在，導(dǎo)致化合物與蛋白的對(duì)接打分值非常低，甚至有些化合物與原配體的對(duì)接打分值還要低，這充分說明化合物與蛋白能夠穩(wěn)定的結(jié)合。其余化合物雖未與蛋白形成相互作用力，但從對(duì)接打分值來看，剩余化合物與蛋白的對(duì)接打分值比其與原配體的對(duì)接打分值還低，形成的主要原因可能是這些化合物基本全部包裹在活性口袋之中，這也為剩余化合物與蛋白能夠穩(wěn)定結(jié)合提供了證據(jù)。

3 討論

通過藏醫(yī)“味性化味”理論分析藏藥四味姜黃湯的藥性，發(fā)現(xiàn)四味姜黃湯方劑的味性特征主為六味中主顯甘味和澀味，三化味中主顯苦化味。根據(jù)藏醫(yī)藥性理論，苦、澀味和苦化味主治“赤巴”病。本方劑的十七效特征以重(21.3)、鈍(19.7)、穩(wěn)(15.2)、干(14.0)、潤(13.2)、輕(12.4)、涼(12.0)為主，主要作用于藏醫(yī)“隆”病的輕、銳、動(dòng)和硬、細(xì)等屬性，“赤巴”病的熱、瀉、濕等屬性，“培根”病的重等屬性；基于三化味的十七效以涼(29.9)、重(21.3)、鈍(21.1)、稀(17.0)、穩(wěn)(13.2)、潤(13.2)為主，主要作用于“赤巴”病的熱和臭等屬性，“隆”病的輕、銳、動(dòng)、硬和細(xì)等屬性。根據(jù)藥物的十七效與“隆”“赤巴”“培根”三病的二十屬性之間的平衡治療關(guān)系，藥性鈍、干、涼主治“赤巴”病，重、穩(wěn)、潤主治“隆”病，輕主治“培根”病，表明四味姜黃湯治療糖尿病腎病遵循以清“赤巴”熱為主、調(diào)“隆”通血?dú)鉃殛P(guān)鍵、消“培根”之重和膩性為根本的治療原則，從而實(shí)現(xiàn)維持藏醫(yī)“三火”生理功能、順通血液循環(huán)的京尼薩庫及糖尿病腎病防治。

圖8 PI3K-Akt信號(hào)通路圖

本研究通過“成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)模型的預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)四味姜黃湯發(fā)揮作用的主要成分有20個(gè)，其中姜黃素、小檗堿、鞣花酸、山柰酚、木犀草素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等7種活性成分均已被報(bào)道具有防治糖尿病及糖尿病腎病的作用。姜黃素為姜黃的主要成分，是通過降低IL-17、VEGF等炎性因子水平和氧化應(yīng)激，減少腎小球分泌LN和Col4，延緩ECM的積聚，減輕腎小球病理變化，從而對(duì)腎臟起到一定程度的保護(hù)作用[10-11]。小檗堿治療糖尿病腎病的作用主要集中于降血糖、改善血流動(dòng)力學(xué)、降血脂、抗炎等方面[12-14]。鞣花酸通過減輕糖尿病腎病小鼠機(jī)體氧化應(yīng)激和減少M(fèi)DA對(duì)細(xì)胞造成的不可逆轉(zhuǎn)的損傷，有助于機(jī)體維持正常生理功能，緩解糖尿病腎病導(dǎo)致的腎損傷[15]。山柰酚對(duì)高糖誘導(dǎo)的HBZY-1細(xì)胞增殖起抑制作用，并通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)，初步證實(shí)其作用的分子機(jī)制可能是通過抑制p38 MAPK信號(hào)通路，從而抑制HBZY-1細(xì)胞的增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)的聚集[16]，另外可抑制糖尿病腎病大鼠腎組織炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，對(duì)腎功能和組織病理損傷具有保護(hù)作用[17-18]。通過實(shí)驗(yàn)推測(cè)，木犀草素是通過提高機(jī)體的抗氧化能力，抑制腎組織TGF-β1和PAI-1蛋白表達(dá)來減輕糖尿病腎臟ECM的過度積聚，對(duì)糖尿病腎臟起到保護(hù)作用[19]。EGCG可以抑制異常糖代謝引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕糖毒性及腎臟損傷[20]。槲皮素是通過改善氧化應(yīng)激和抗炎的作用機(jī)制，對(duì)早期糖尿病腎病起到保護(hù)作用[21-23]，以上研究報(bào)道與本文預(yù)測(cè)的結(jié)果存在一致性，明確了本次網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)預(yù)測(cè)的可靠性，為今后繼續(xù)研究相關(guān)成分對(duì)抗糖尿病腎病的作用機(jī)制提供了重要依據(jù)。

表3 活性成分和核心靶標(biāo)分子對(duì)接分值表

圖9 四味姜黃湯散與糖尿病腎病核心靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果圖

依據(jù)四味姜黃湯PPI互作網(wǎng)絡(luò)分析得出，主要靶點(diǎn)為VEGFA、CASP3、HSP90AA1、ESR1等，VEGF在腎臟表達(dá)于腎小球足細(xì)胞、遠(yuǎn)端腎小管和集合管，在近端腎小管也有少量表達(dá)[24]，可以促進(jìn)血管發(fā)生、血管形成、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和增強(qiáng)血管通透性[25]，因此，四味姜黃湯通過調(diào)節(jié)VEGF誘導(dǎo)血管新生，保護(hù)血管，從而改善糖尿病腎病。CASP3參與細(xì)胞凋亡效應(yīng)[26]，阻斷CASP3基因的表達(dá)對(duì)腎臟具有保護(hù)作用[27-28]。Hsp90是廣泛存在于生物體內(nèi)一種高度保守的伴侶分子[29]，在早期糖尿病腎病大鼠的發(fā)生發(fā)展中起非常重要的作用，主要是Hsp90α與eNOS相互作用，使eNOS與Caveolin-1解離減少，或者可能通過PI3K/Akt通路，降低eNOS Ser1177磷酸化蛋白表達(dá)，降低內(nèi)皮細(xì)胞eNOS酶活性，引起內(nèi)皮功能障礙[30]，揭示Hsp90α通過調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞功能防治糖尿病腎病的血管病變。雌激素與經(jīng)典受體結(jié)合作用于基因組，防止胰島B細(xì)胞凋亡，使其分泌的胰島素增加，進(jìn)而降低血糖，同時(shí)，還可以與非典型的受體結(jié)合，通過眾多級(jí)聯(lián)反映促進(jìn)胰島素分泌，增加胰島素敏感性來防治糖尿病腎病[31]。

GO注釋結(jié)果表明，生物功能主要富集在磷脂酶C活性和蛋白激酶B信號(hào)通路的正調(diào)控、血清蛋白/三絲質(zhì)激酶活動(dòng)、序列特異性糖尿病腎病A結(jié)合MAP激酶活性的正調(diào)控、ATP結(jié)合等。KEGG通路主要富集在PI3K-Akt信號(hào)通路、黏附、癌癥相關(guān)通路、MAPK信號(hào)通路等，其中PI3K/Akt信號(hào)通路是抑制細(xì)胞凋亡的重要信號(hào)通路[32]，表明四味姜黃湯多通路防治糖尿病腎病。分子對(duì)接結(jié)果表明，活性成分谷甾醇、豆甾醇、余甘根苷A與VEGFA、 CASP3核心蛋白之間形成了氫鍵和π-H共軛鍵等相互作用力，且結(jié)合親和力較強(qiáng)，具有潛在的研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，本研究應(yīng)用藏醫(yī)“味性化味”理論和生物信息學(xué)方法，分析了藏藥四味姜黃湯防治糖尿病腎病的作用機(jī)制，藏藥藥性理論、網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)分析結(jié)果相互支持，體現(xiàn)了藏藥多成分、多靶點(diǎn)、多個(gè)通路協(xié)同作用的的特點(diǎn)，為下一步開展四味姜黃湯治療糖尿病腎病的機(jī)制研究提供了方向。鑒于此，本課題后續(xù)將結(jié)合分子生物學(xué)和病理生理學(xué)等方法，繼續(xù)開展藏藥四味姜黃湯防治糖尿病腎病的機(jī)制研究。