QuEChERS結合UPLC-MS/MS法測定茵梔黃口服液中14種農藥殘留

李 媛， 王 娟， 張 楠， 謝志民

(西安市食品藥品檢驗所，陜西 西安 710054)

茵梔黃口服液收載于2015年版《中國藥典》，處方由茵陳提取物、梔子提取物、黃芩提取物和金銀花提取物[1]組成，具有清熱解毒，利濕退黃的功能。其中梔子、黃芩、金銀花商品藥材主要為種植產品。據文獻報道[2]，花和果實類藥材、部分多年生根和根莖類藥材農藥殘留污染比較嚴重，尤其是花類藥材檢出率最高。部分農藥殘留直接危害人體健康。本品經常用于新生兒黃疸的治療中，控制農藥殘留尤為重要。本實驗選取上述梔子[3]、黃芩[4]、金銀花[5-9]藥材可能使用及常用的農藥，結合已有文獻報道[10]檢出的農藥種類，擬對啶蟲脒、仲丁威、敵百蟲、毒死蜱、吡蟲啉、滅幼脲、辛硫磷、樂果、托布津、甲基托布津、克百威、吡蚜酮、敵敵畏、馬拉硫磷14種農藥采用液-質聯用方法進行測定，作為茵梔黃口服液安全性的質量控制方法之一。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-30 AD型超高效液相色譜儀；LCMS 8060三重四極桿質譜儀，LabSolutions工作站；島津Shim-pack GIST C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2 μm)。

1.2 試劑 乙腈(色譜純，德國Fisher公司)；甲酸、乙酸(色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司)；氯化鈉、無水硫酸鎂(分析純，國藥集團化學試劑有限公司)；PSA，GCB(分析純，天津博納艾杰爾公司)。啶蟲脒對照品(批號201905，含量100 μg/mL)由農業部環境保護科研檢測所提供；仲丁威(批號G170133，純度98.4%)、吡蚜酮(批號G832819，純度97.8%)、托布津(批號G980847，純度97.7%)、毒死蜱(批號G130559， 純度99.8%)對照品均由德國Dr.Ehrenstorfer公司提供；敵百蟲(批號M3H1，含量100 μg/mL)、吡蟲啉(批號A3X1，含量100 μg/mL)、滅幼脲(批號1901，含量100 μg/mL)、辛硫磷(批號N222，含量100 μg/mL)、樂果(批號1901，含量100 μg/mL)、甲基托布津(批號1902，含量100 μg/mL)、克百威(批號A3Z1，含量100 μg/mL)、敵敵畏(批號J3X2，含量100 μg/mL)、馬拉硫磷(批號M3H2，含量100 μg/mL)對照品均由北京海岸鴻蒙標準物質技術有限責任公司提供。

1.3 藥物 32批茵梔黃口服液和6批茵梔黃注射液、黃芩提取物(A35190111004)、梔子提取物(T181004)和金銀花提取物(T181201)均購自北京華潤高科天然藥物有限公司。低、中、高質量濃度空白茵梔黃口服液樣品為本實驗室自制，不含待測農藥。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液制備 精密量取茵梔黃口服液(批號20181206)10 mL[注射液(批號171023A1)20 mL]，置于50 mL離心管中，加入0.1%乙酸乙腈10 mL(注射液20 mL)，渦旋混勻1 min，加入氯化鈉1 g(注射液2 g)、無水硫酸鎂4 g(注射液8 g)，渦旋混勻1 min，3 500 r/min離心5 min，精密量取上清液2 mL(注射液4 mL)，加入無水硫酸鎂300 mg(注射液600 mg)、PSA 100 mg(注射液200 mg)、GCB 20 mg(注射液40 mg)，渦旋混勻1 min，3 500 r/min離心5 min，精密量取上清液1 mL，減壓濃縮至干，乙腈∶水(3∶2)定容至1 mL，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。同法制備僅含黃芩提取物模擬樣品(A35190111004)、僅含梔子提取物模擬樣品(T181004)、僅含金銀花提取物模擬樣品(T181201)的供試品溶液。

2.2 對照品溶液制備 精密稱取/量取各對照品適量，乙腈-水(3∶2)制成每1 mL分別含托布津14 ng、吡蚜酮13 ng、仲丁威8 ng、毒死蜱5 ng、克百威2 ng、樂果1 ng、辛硫磷2 ng、敵百蟲4 ng、吡蟲啉10 ng、啶蟲脒10 ng、甲基托布津12 ng、馬拉硫磷40 ng、滅幼脲65 ng、敵敵畏40 ng的溶液，搖勻，即得。取空白茵梔黃口服液樣品，按“2.1”項下方法處理，作為空白基質，制備基質匹配對照品溶液，見圖1。

1.吡蚜酮 2.敵百蟲 3.吡蟲啉 4.樂果 5.啶蟲脒6.敵敵畏 7.甲基托布津 8.克百威 9.托布津 10.仲丁威11.馬拉硫磷 12.滅幼脲 13.辛硫磷 14.毒死蜱圖1 各農藥TIC色譜圖

2.3 分析條件

2.3.1 色譜 Shim-pack GIST C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，2 μm)；流動相 0.1%甲酸(A)- 乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，95% A；1～4 min，95%～70% A；4～7 min，70%～50% A；7～15 min，50%～30% A；15～20 min，30%～5% A)；體積流量0.3 mL/min；柱溫35 ℃；進樣量2 μL。

2.3.2 質譜 電噴霧離子源(ESI)，滅幼脲采用負離子模式(ESI-)，其余均采用正離子模式(ESI+)；多反應檢測(MRM)模型，參數見表1；霧化氣體積流量3 L/min；加熱氣體積流量10 L/min；干燥氣體積流量10 L/min；接口溫度300 ℃；DL溫度250 ℃；加熱塊溫度400 ℃。

2.3.3 監測離子選擇 采用Scan模式，以m/z150～400進行掃描，確定保留時間并進行分段采集，MS參數見表1。

表1 各農藥MS參數

2.4 基質效應 分別以各農藥峰面積、對照品系列質量濃度繪制基質對照曲線、溶劑對照曲線，通過對比兩者斜率來考察基質效應[11-12](ME)，公式為ME=A/B×100%，其中A為目標成分在基質匹配對照品溶液中標準曲線的斜率，B為目標成分在系列對照品溶液中標準曲線的斜率，ME>100%表示呈基質增強效應，ME<100%表示呈基質減弱效應，ME>150%表示呈顯著的基質增強效應。精密量取低、中、高質量濃度空白茵梔黃口服液，按“2.1”項下方法處理后加同一質量濃度對照品溶液準確定容，得到基質，在“2.3”項條件下進樣測定，結果見表2。由此可知，14種農藥均存在不同程度的基質效應，基質濃度越大，對各農藥的影響越強，其中毒死蜱、馬拉硫磷等大部分農藥呈基質抑制效應，而敵敵畏呈顯著的基質增強效應。為了減少基質效應對檢測結果的影響，本實驗采用空白基質配制對照品溶液。

表2 各農藥基質效應測定結果(%)

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 用基質匹配的對照品溶液逐級稀釋，制得農藥對照品溶液，在“2.3”項條件下進樣測定，以各農藥質量濃度為橫坐標(X)，峰面積為縱坐標(Y)進行回歸，以信噪比(S/N)=10時為定量限，結果見表3，可知各農藥在各自范圍內線性關系良好。

2.5.2 重復性試驗 精密量取茵梔黃口服液(批號20181206)10 mL，以5 μg/L水平添加，按“2.1”項下方法處理，平行檢測6次，RSD<10%，重復性良好。

2.5.3 穩定性試驗 分別于0、1、4、8、12、16、20、24 h精密吸取重復性考察項同一供試品溶液，以5 μg/L水平添加，按“2.1”項下步驟進行前處理，在“2.3”項條件下進樣測定，測得各農藥峰面積RSD均≤10%，表明農藥殘留在24 h內穩定性良好。

2.5.4 準確度、精密度試驗 向空白基質品中添加低、中、高質量濃度(1、5、10 μg/L)農藥對照品溶液，按“2.1”項下方法制備供試品溶液，平行3份，在“2.3”項條件下進樣測定，結果見表4。

2.6 農藥殘留測定 6批茵梔黃注射液均未檢測到14種農藥，而32批茵梔黃口服液均檢測到啶蟲脒、吡蟲啉，含量分別為在4.7～7.9、8.0～14.6 μg/L范圍內。雖均未超出安全限度，但應引起關注，特別是嬰幼兒制劑尤為重要。

3 結果與討論

3.1 色譜條件及樣品制備方法考察 分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水流動相系統及不同濃度甲酸的效果，結果乙腈-0.1%甲酸水為最佳條件。樣品提取過程中比較酸性乙腈、丙酮和乙酸乙酯對于目標農藥的提取效果，結果顯示酸性乙腈提取效率較高且雜質較少，故選擇酸性乙腈作為提取溶劑。樣品中有大量色素雜質, 且輔料中含蜂蜜、蔗糖等雜質，凈化采用PSA、GCB及無水硫酸鎂組合。PSA吸附劑清除樣品中的脂肪酸、親脂性色素和糖類等極性成分進行分散固相萃取，GCB用于除去樣品中的色素雜質，無水硫酸鎂吸取多余的水分，最后根據回收率情況與凈化效果優化無水硫酸鎂、PSA、GCB的用量。

表3 各農藥線性關系

表4 空白樣品加樣回收試驗結果(n=3)

3.2 基質效應 由基質效應表可以看出，大部分農藥為基質抑制作用，推測可能是由于與被分析物一起流出的其他內源性物質(如鹽類、胺類、脂肪酸、甘油酸酯等)造成的。這些物質與分析物共同流出噴霧針，對電荷產生競爭，改變了帶電霧滴的表面張力，影響分析物的霧化、揮發、裂分、化學反應及帶電過程，致使進入質譜的離子減少[13]。由表2看出敵百蟲、辛硫磷基質效應較為強烈，分析其原因可能是由于其含有極性的及強氫鍵的結構P=O、-N=等基團，含有此類結構化合物通常具有較為嚴重的基質效應。

3.3 農藥殘留分析 國標中啶蟲脒的ADI為0.07 mg/kg，歐盟標準為0.025 mg/kg；國標中吡蟲啉的ADI為0.06 mg/kg，按照2015年版《中國藥典》四部9302中藥中有害殘留物限量制定指導原則計算，得茵梔黃口服液中啶蟲脒的最大限量為1.4 μg/mL、吡蟲啉的最大限量為1.2 μg/mL。按照歐盟標準計算啶蟲脒的最大限量為0.5 μg/mL。結果32批口服液均未超出限度范圍，注射液未檢出，分析可能由于工藝影響。同時在金銀花提取物檢出克百威、啶蟲脒和吡蟲啉，黃芩提取物檢出辛硫磷，梔子提取物未檢出農藥殘留，茵陳多為野生，故不作考慮。茵梔黃口服液中的農藥殘留來自于處方中的金銀花提取物，應關注金銀花的農藥殘留情況。