單細胞水平解析中性粒細胞異質性的研究進展①

謝雪梅 任 仟 羅鴻博 馬鳳霞 （中國醫學科學院血液病醫院，中國醫學科學院血液學研究所，實驗血液學國家重點實驗室，國家血液系統疾病臨床醫學研究中心，細胞生態海河實驗室，天津300020）

近年來，越來越多的研究證明中性粒細胞具有異質性，全面、深入地解析細胞的異質性需要了解群體中每個細胞基因表達的詳細信息［1-3］。但是，傳統的批量測序會同時處理成千上萬個細胞，得到群體基因表達的平均值。單細胞水平的轉錄組測序技術可以揭示每個細胞的轉錄組表達，通過找到細胞的特異高表達基因，進一步挖掘已知細胞類型的異質性甚至發現全新的細胞類型［4-5］。而且，單細胞轉錄組測序數據分析的過程可以對細胞進行無監督分群，這種新型的減少人為因素干擾的分群方法可以用統一及嚴格的原則定義不同的免疫細胞類型和不同免疫應答下的細胞狀態［6］。因此，從單細胞水平研究中性粒細胞生理及病理條件下的異質性，揭示各發育階段、各器官中性粒細胞亞群及其演變關系，將推動整個中性粒細胞領域的發展，甚至發現新的中性粒細胞亞型。近年來，中性粒細胞異質性的研究取得了顯著進展，本綜述將總結中性粒細胞異質性的進展并重點闡述在單細胞水平解析中性粒細胞異質性的研究，最后討論中性粒細胞產生異質性的可能機制。

1 中性粒細胞發育、成熟、衰老及死亡

中性粒細胞來源于骨髓中的造血干祖細胞，一個正常成人骨髓每天產生1×1011～2×1011個中性粒細胞，而一只成年小鼠骨髓每天產生1×107個中性粒細胞［7］。中性粒細胞的成熟經歷了從原始粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞、晚幼粒細胞、桿狀核和分葉核細胞的過程。原始粒細胞、早幼粒細胞、中幼粒細胞均可以通過有絲分裂而增殖，晚幼粒細胞、桿狀核和分葉核細胞不能進行有絲分裂［8］。

在中性粒細胞的不同發育階段，有不同的顆粒出現，這些顆粒中含有特定的蛋白來發揮生物學效應［9-10］。原始粒細胞無顆粒形成，早幼粒細胞出現嗜天青顆粒（初級顆粒）。中幼粒和晚幼粒細胞出現特異顆粒（二級顆粒），而明膠酶顆粒（三級顆粒）在晚幼粒細胞向桿狀核轉變過程中形成，分泌微泡僅存在于分頁核細胞中。嗜天青顆粒含有豐富的髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）和一系列抗菌肽。另外，嗜天青顆粒包含絲氨酸蛋白酶如蛋白酶3（proteinase 3，PR3），組織蛋白酶、彈性蛋白酶（neu?trophil elastase，NE）等，以上蛋白酶除了能夠水解細胞外基質成分，還具有殺菌功能［11］。更有意思的是，發現蛋白PR3 和NE 通過剪切caspase 3 和焦亡的執行蛋白Gasdermin D 在中性粒細胞死亡中發揮重要的作用［12-13］。乳鐵蛋白是特異顆粒的主要成分，通過結合鐵離子，能破壞細菌壁從而具有直接的殺菌活性。特異顆粒的另一成分是中性粒細胞明膠酶相關脂質運載蛋白（neutrophil gelatinase as?sociated lipocalin，NGAL），與乳鐵蛋白具有協同抗菌作用。明膠酶顆粒的主要成分有明膠酶和精氨酸酶。關于中性粒細胞顆粒蛋白的形成，目前研究者們公認的解釋是“生物合成的時間決定（targeting by timing of biosynthesis）”假說［14］。該假說認為同一顆粒中的不同顆粒蛋白同時開始合成，同時合成結束，即同一發育階段產生的顆粒蛋白會儲存在相同的顆粒里。

成熟的中性粒細胞從骨髓內被釋放至外周血受基質來源的細胞因子（stromal derived factor-1，SDF-1）及其受體CXCR4調節，骨髓成熟中性粒細胞中低表達CXCR4，從而被動員到外周血。而衰老的中性粒細胞上調表達CXCR4［15］。目前研究者們認為衰老的中性粒細胞是一個具有特定表型的中性粒細胞亞群，它們下調表達L-選擇素，細胞體積變小及分葉核增多，整合素激活增加、形成胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的能力增強［16］。有意思的是，中性粒細胞的衰老受晝夜節律的影響，早上8：30（zeitgeber time 13，ZT13）機體外周血的衰老中性粒細胞數量最少，中午12：30（ZT5）外周血中衰老中性粒細胞數量最多［17］。研究人員還發現微生物可以通過Toll樣受體和MyD88介導的信號途徑誘導中性粒細胞衰老，清除微生物能夠顯著減少循環中衰老的中性粒細胞數量，并能夠改善感染引起的器官損傷［18］。循環中衰老的中性粒細胞最終被募集到骨髓從而被骨髓巨噬細胞清除，細胞衰老可能是中性粒細胞異質性形成的原因之一。

中性粒細胞最顯著的特征是壽命短，一般認為中性粒細胞在血液循環中的壽命只有7～20 h，但是，最近的一項研究表明人的中性粒細胞在體內可以存活5.4 d［19］。長期以來研究者普遍認為中性粒細胞自發死亡的方式是凋亡，最近發現中性粒細胞的自發死亡方式還有裂解性死亡，而且受Gasdermin家族蛋白的調控［13］。中性粒細胞死亡方式和速率的不同也可能是中性粒細胞異質性形成的原因，而且，通過單細胞轉錄組測序，本課題組發現中性粒細胞自發死亡過程中可以產生不同的亞群，這些亞群特異高表達的基因可富集到不同的死亡信號通路。

2 生理狀態下中性粒細胞的異質性

生理狀態下，除了骨髓、外周血、脾臟和肺，其他組織的中性粒細胞數量較少。骨髓儲存了大量的成熟中性粒細胞，這些細胞在組織損傷或急性炎癥時被大量動員至外周血，進而到達外周組織發揮作用。KIM等［20］采用流式分析在骨髓中發現了一群中性粒前體細胞，這群細胞的表型為lin-c-Kit+CD11b+Ly6GloLy6BintCD115-Gfi1+，被命名為NeuP，具有增殖潛能，在體內、體外均能分化為成熟的中性粒細胞并能發揮殺菌功能。在小鼠的肺臟，大部分中性粒細胞位于肺毛細血管的邊緣，微生物感染時它們能快速被趨化至感染部位［21］。在小鼠脾臟中，不成熟的中性粒細胞是不能游動的，而成熟的中性粒細胞在紅髓發揮偵察兵的作用。更有意思的是，在人脾臟的邊緣區，中性粒細胞獲得了能刺激B 細胞產生免疫球蛋白的特征，被稱為輔助B 細胞的中性粒細胞［22］。以上研究說明組織中的中性粒細胞具有免疫哨兵的作用并獲得了組織特異的特征，骨髓、外周血、脾臟和肺臟的中性粒細胞之間的異同點和相互關系還是未知。

本課題組對小鼠生理狀態下的骨髓、外周血和脾臟的中性粒細胞進行了單細胞RNA 測序，并結合生物信息學方法建立了生理狀態下中性粒細胞轉錄組圖譜［23］。按照發育成熟的順序，骨髓中的中性粒細胞可以分為5 群，包括3 個處于分裂階段的亞群（G0、G1、G2）和2 個分裂后的較成熟亞群（G3、G4）。還分析了外周血及脾臟中的中性粒細胞，發現外周器官中主要存在3個具有不同轉錄組特征的成熟中性粒細胞亞群，G5a、G5b和G5c，其中，G5b高表達IFN 刺激相關基因（interferon stimulated gene，ISG），而且在脾臟中有獨特的空間分布，提示該亞群可能具有不同于其他亞群的宿主防御功能。除了小鼠，本課題組還證明生理狀態下人外周血也包含3個亞群，以及人G5b也高表達ISG。

傳統的觀點認為中性粒細胞顆粒蛋白的分布由合成的時間決定，但是該觀點逐漸受到質疑。本課題組發現抗菌肽CAP-18的基因Camp主要表達于二級顆粒形成的G2 和G3 群，同時，基因Camp也表達于主要包含三級顆粒的G4 群。基因Lcn2是二級顆粒蛋白NGAL 的基因，也在G4細胞群高表達。明膠酶被認為僅僅存在于二級顆粒，但是，在單細胞水平明膠酶的基因Mmp8在G4 細胞群高表達，幾乎不表達于G2 細胞群。根據上述顆粒蛋白基因在亞群之間表達的差異，本課題提出了顆粒蛋白產生的“分選假說”（sorting mechanism）。雖然蛋白是細胞生命活動的執行者，最近研究表明在中性粒細胞發育過程中，高達70%的基因表達和蛋白表達趨勢一致［24］。

有一些研究在單細胞水平分析中性粒細胞及其前體細胞的異質性，這些研究側重點不同，但是從不同角度解析了中性粒細胞的異質性。2016 年，OLSSON等［25］對造血干細胞（LSK），共同髓系祖細胞（CMP）粒-單核祖細胞（GMP）和CD34+LK（linageckit+）細胞進行了單細胞RNA測序，把Olsson的測序數據與本課題組數據進行了比對，證明LSK 和CMP的基因表達模式與G0 群一致，GMP 包含G1 群，而CD34+LK 細胞包含大約20%的G2 群細胞。2018 年GILADI 等［26］對骨髓中性粒細胞進行單細胞轉錄組分析，他們定義了兩個中性粒細胞組stageⅠ和stageⅡ，把Giladi 的測序數據與本研究組的數據進行了比對，相關性分析揭示stageⅠ中性粒細胞主要是G2～G4 群，而stageⅡ中性粒細胞是G4 和G5 群的混合。2018 年，利用質譜流式和細胞增殖活性分析并結合生物信息學分析，EVRARD 等［27］發現骨髓內存在 3種中性粒細胞亞群：preNeu、immNeu和mNeu。preNeu 低表達c-Kit，具有增殖活性，表達一級和二級顆粒蛋白。immNeu 低表達CXCR2，不具有增殖活性，高表達二級顆粒蛋白。mNeu 高表達CXCR2并高表達三級顆粒蛋白。這3種中性粒細胞亞群與本課題組發現的G1/G2、G3、G4 中性粒細胞相對應。同年，借助質譜流式和單細胞RNA 測序，ZHU 等［28］在小鼠和人的骨髓鑒定了一種具有增殖活性的單能中性粒祖細胞，這種祖細胞又可以進一步分為兩個細胞群，早期ckit+Gfi1lowCebpahiLy6Glow祖細胞群具有干細胞的特征而晚期ckit+Gfi1lowCebpalowLy6G+祖細胞群與EVRARD 等［27］發現的preNeu 非常相似。2020 年，KWOK 等［29］通過結合單細胞轉錄組學和蛋白質組學分析發現GMP 具有異質性并揭示GMP 包含一種單能中性粒前體細胞并將其命名為proNeu。proNeu 根據表型又可以分為proNeu1 亞群（CD34hiCD106-CD11blo）和proNeu2亞群（CD34loCD106+CD11bhi），基于分化等級的分析，進一步確定了pro?Neu1 可以分化為proNeu2，ProNeu2 可以分化為pre?Neu 和immNeu，而且proNeu 與本研究組定義的G1群具有很好的相關性。整合以上對中性粒細胞多組學的研究，按照發育成熟的順序，骨髓中發育階段的中性粒細胞可以分為proNeu、preNeu、immNeu和mNeu。

3 急性炎癥時中性粒細胞的異質性

急性炎癥時，骨髓中的中性粒細胞被大量動員至外周組織，外周組織中增加的中性粒細胞是否具有組織特異性有待深入研究。受因子G-CSF動員的人外周血含有CD66b+CD10+成熟中性粒細胞和CD66b+CD10-不成熟中性粒細胞，成熟的細胞抑制T 細胞的增殖和IFN-γ 的產生，相反，不成熟的細胞促進T 細胞的增殖和IFN-γ 的產生［30］。與G-CSF 類似，低劑量LPS 注射后3 h，人外周血循環的中性粒細胞出現3種形態和表型不同的亞群，分別為桿狀核（CD16dim/CD62Lbright）、多分葉核（CD16bright/CD62Ldim）、正常分葉核（CD16bright/CD62Lbright），其中CD16bright/CD62Ldim亞群抑制淋巴細胞激活［31］。2018 年LE?LIEFELD 等［32］發現，在急性細菌感染時，人外周血有一群CD16bright/CD62Ldim的多頁核中性粒細胞吞噬細菌的能力明顯低于其他細胞，相反，CD16dim的桿狀核中性粒細胞吞噬較多的細菌，以上發現表明急性感染時人外周血存在抗菌能力不同的中性粒細胞亞群。

2004 年一篇研究發現小鼠體內的中性粒細胞可以分為3 種亞群，PMN-N、PMN-Ⅰ和PMN-Ⅱ，PMN-Ⅰ存在于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）抵抗的小鼠，而PMN-Ⅱ存在于MRSA 敏感的小鼠，PMN-N 存在于無細菌感染的小鼠中［33］。它們具有不同的表型：PMN-Ⅰ為CD49d+CD11b-，PMN-Ⅱ為CD49d-CD11b+，PMN-N 為CD49d-CD11b-。它們分泌的細胞因子也不同，PMN-Ⅰ主要分泌IL-12/CCL3，PMN-Ⅱ主要分泌IL-10/CCL2，而PMN-N 不分泌細胞因子。2016 年Blood 上的一篇研究證明LPS誘導的腹膜炎小鼠，循環及腹腔中性粒細胞ICAM表達增加，ICAM 陽性的中性粒細胞遷移能力不變，吞噬能力增強［34］。

為了更深入地研究急性感染對中性粒細胞亞群的影響，本研究組分離了急性腹膜炎小鼠的骨髓、外周血、脾臟及腹腔灌洗液的中性粒細胞進行單細胞RNA 測序和分析。發現在炎癥狀態下的中性粒細胞亞群的核心轉錄組特征沒有改變，無新的亞群產生，也沒有已有亞群的消失，但各群體的數目比例、功能特征、轉錄因子表達和群體轉化路徑等發生了明顯變化。急性腹膜炎時，PMNb 亞群大量擴增，在感染的小鼠脾臟，所有中性粒細胞一致地分布于紅髓，而PMNb 細胞主要定位于被膜下區域，進一步證明PMNb 亞群是獨特的。有意思的是，經RNA 速度分析（RNA Velocity），炎癥時immNeu到PMNa 的轉變受到抑制，immNeu 主要分化為成熟的中性粒細胞。急性感染誘發中性粒細胞數量增加主要是因為更前體的proNeu 分裂增加而不是接近成熟的preNeu，而preNeu 負責穩態時大部分細胞的增殖。可能的解釋是，穩態時preNeu 的增殖比例已經非常高，更前體的proNeu 分裂增加將是促進急性粒細胞產生的更有效的方式。急性炎癥也能明顯縮短分裂后的成熟期使骨髓的中性粒細胞快速成熟。EVRARD 等［27］也發現敗血癥時，preNeu 在骨髓和脾臟中擴增并可以被動員至血液等外周組織。KWOK 等［29］發現proNeu1，而非proNeu2，在敗血癥誘導的急性髓系造血時特異性擴增。

4 腫瘤狀態下中性粒細胞的異質性

越來越多研究表明中性粒細胞在腫瘤發生、發展和轉移中起著重要的作用，這些細胞被稱為腫瘤相關中性粒細胞（tumor associated neutrophils，TAN）。根據TAN的表型和功能不同，可以分為抗腫瘤的N1和促腫瘤的N2 亞群［35-36］。IFN-β 和TGF-β 能分別促進TAN 極化為Nl 和N2 型。SAGIV 等［37］在腫瘤小鼠和患者的外周血中鑒定出3種不同的循環中性粒細胞群：①高密度成熟的、形態較小的抗腫瘤中性粒細胞；②低密度成熟的、形態大的抗腫瘤中性粒細胞；③低密度未成熟的、細胞較大的骨髓來源的髓系抑制細胞（G-MDSC）。低密度中性粒細胞（low density neutrophils，LDN）包括不成熟的MDSC 和在TGF-β 作用下從高密度中性粒細胞（high density neutrophils，HDN）轉化而來的成熟的細胞。與HDN相比，LDN 具有弱的遷移、吞噬和活性氧產生能力，強的免疫抑制能力。其中，G-MDSC 是具有免疫抑制功能的未成熟中性粒細胞，小鼠G-MDSC 的表型是CD11b+Ly6GhiLy6Clo，人G-MDSC 的表型是CD14-CD11b+CD15+（或CD66b+）［38-40］。

研究者對不同的腫瘤中性粒細胞做了轉錄組測序，結果表明，TAN、G-MDSC 和幼稚中性粒細胞具備不同的基因表達譜，與TANs 相比，G-MDSCs 和幼稚的中性粒細胞非常接近［41］。TANs 顯著下調與細胞毒性有關的基因，相反，許多與免疫相關的基因和信號通路，均在G-MDSC中上調，并在TAN中進一步上調。2019年，利用單細胞轉錄組測序，ZILIO?NIS 等［42］繪制了小鼠和人肺腫瘤中浸潤髓系細胞包括中性粒細胞的轉錄組圖譜，發現中性粒細胞在人類肺腫瘤中有5 種亞型（hN1～5），而在小鼠肺腫瘤中形成6 種亞群（mN1～6），其中小鼠的3 種亞群（mN4～6）高表達SiglecF，它們在腫瘤中高度富集并具有促進腫瘤的特性。還發現hN1 和mN1 主要表達經典的中性粒細胞標志如MMP8、MMP9、S100A8、S100A9，而hN5 和mN5 主要表達細胞因子CCL3、CSF1。有趣的是，還發現hN2 和mN2 是特殊的亞群，它們雖然數量很少，但是高表達ISG 如IFIT1、IRF7、RSAD2。

此外，由原發腫瘤產生的細胞因子如IL-1β，粒細胞集落刺激因子（G-CSF）或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）可以誘導中性粒細胞生成促進未成熟中性粒細胞從骨髓釋放到外周血和腫瘤部位［43］。不成熟中性粒細胞在腫瘤小鼠的脾臟也會擴增，因此，與炎癥類似，癌癥會觸發一種“急性”粒細胞造血，促進中性粒細胞異質性的產生［44］。

5 中性粒細胞異質性形成的機制

在發育、成熟過程中，不同的發育階段中性粒細胞亞群的產生，中性粒細胞自身的特征如快速衰老、生存期短和跨內皮遷移等均能導致中性粒細胞異質性的產生，微環境和疾病也能改變中性粒細胞的功能和行為。雖然目前大家認為中性粒細胞是存在異質性的，主要的爭議是中性粒細胞的不同表型是否代表真正的中性粒細胞亞群，或者僅僅是不同的細胞狀態。現在越來越多的證據證明，中性粒細胞的亞群和表型的變化是通過轉錄組和表觀遺傳組共同調節的。

成熟中性粒細胞具有獨特的分葉核形狀，每個分葉由線性的DNA 鏈接起來，這種致密的結構方便粒細胞的遷移以及吞噬，并且有利于NETs 的形成［46］。研究表明致密的核結構也限制了中性粒細胞轉錄活動，與其他髓系細胞相比，成熟中性粒細胞RNA 的含量較低。以往研究者們認為，由于轉錄活動的不活躍，中性粒細胞的異質性不高。但現階段研究結果表明，中性粒細胞基因表達的重塑發生在其整個發育的過程中［47］。在中性粒細胞的成熟過程中，數百個與生物合成和增殖過程相關的基因會下調，而與顆粒合成、抗菌免疫應答等基因會上調。值得注意的是，與骨髓未成熟細胞相比，與抗病毒防御相關的基因在循環中性粒細胞會特異上調，表明即使終末分化的中性粒細胞，轉錄活動也是活躍的。再者，表觀遺傳組的變化，比如基因調控元件、組蛋白和核小體的標記也發生在中性粒細胞的發育過程中［48］。人的中性粒細胞除了轉錄組的差異，基因甲基化也存在差異，表明表觀遺傳參與中性粒細胞基因的表達調控［49］。所以，單細胞轉錄組測序、蛋白質學、基因組學、開放染色質學的多組學研究的興起，可以更好、更全面地研究中性粒細胞的發育和異質性等特點。

6 總結

本綜述總結了單細胞水平解析中性粒細胞異質性的研究進展，同時，發現中性粒細胞死亡過程中也存在異質性，即死亡的方式和速率不同，本課題組正在利用單細胞測序研究人和小鼠中性粒細胞不同死亡階段的轉錄組特征并分析不同的中性粒細胞亞群受哪些死亡相關基因或信號途徑的控制，而且將利用感染或無菌性炎癥模型研究死亡方式和速率不同的細胞亞群對機體炎癥程度和防御能力的影響。

由于中性粒細胞參與很多疾病的病理過程，包括急性、慢性的病原體感染、腫瘤微環境的構建和自身免疫性疾病等，并且會參與疾病治療如放療和化療后的康復。所以，越來越多的研究者開始關注中性粒細胞的異質性。利用單細胞轉錄組測序探尋疾病狀態下中性粒細胞異質性的改變將是研究熱點，因為其將有助于了解疾病病理過程和尋找更特異的作用靶點，為疾病的治療提供新思路。但是轉錄組的數據不能完全解釋細胞功能，因為細胞功能主要由蛋白決定。所以，結合單細胞水平的轉錄組、蛋白組、代謝組、表觀組和成像技術將會是未來的趨勢，能更精確和全面地解析中性粒細胞的異質性。