BTBR自閉癥小鼠免疫異常研究進(jìn)展①

李 萌 申 晨 曹 霞 （昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，昆明650101）

自閉癥譜系障礙（autism spectrum disorders，ASD）是一種常見的神經(jīng)發(fā)育障礙性疾病，臨床表現(xiàn)為社交、溝通缺陷和刻板行為增加。目前，我國學(xué)齡期兒童ASD 患病率約為0.7%（1/142），男女比例為4.1：1，男性患病率顯著高于女性，據(jù)此估算，我國6～12 歲兒童中ASD 患病人數(shù)高達(dá)70～100 萬［1］。越來越多的證據(jù)表明，免疫功能異常與ASD 患者行為異常及認(rèn)知受損相關(guān)，免疫功能障礙和神經(jīng)發(fā)育障礙緊密關(guān)聯(lián)［2］，但其免疫失調(diào)的機(jī)制尚未闡明，阻礙了深入理解ASD 發(fā)病機(jī)制、尋找潛在預(yù)防及治療策略的進(jìn)程。特發(fā)性ASD 動(dòng)物模型BTBR-T（+）tf/J（BTBR）小鼠可用于ASD 免疫失調(diào)研究，為ASD 生物學(xué)研究提供了可能。BTBR 小鼠是一種近交系小鼠，不僅具有與ASD 患者相似的行為學(xué)特征（如社交能力下降、重復(fù)性自我修飾行為增加），也表現(xiàn)出與ASD 患者相似的持續(xù)性免疫系統(tǒng)失調(diào)，一直被認(rèn)為是研究ASD 較適合的臨床前模型。本文總結(jié)了近年對BTBR 小鼠模型免疫系統(tǒng)失調(diào)的研究結(jié)果，為利用BTBR 小鼠研究ASD 病理機(jī)制提供了重要線索。

1 細(xì)胞因子表達(dá)異常

細(xì)胞因子失調(diào)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響一直是神經(jīng)發(fā)育障礙研究的熱點(diǎn)。2019年發(fā)表的一篇回顧研究系統(tǒng)性總結(jié)了1 393 例ASD 患者細(xì)胞因子的變化，發(fā)現(xiàn)ASD 患者血漿中IFN-γ、IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-8和IL-12（p40）等多種細(xì)胞因子水平顯著升高，且部分細(xì)胞因子水平提高與患者溝通障礙和異常行為損傷程度相關(guān)［3-4］。與ASD 患者研究結(jié)果類似，BTBR 小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子水平也明顯升高。BTBR 小鼠全腦中細(xì)胞因子IL-33、IL-18、IL-1β、IL-10、IL-6 表達(dá)明顯高于B6 小鼠，黑質(zhì)和小腦區(qū)域表達(dá)差異最為顯著，且大腦中IL-33 增多與BTBR 小鼠異常行為模式相關(guān)［5］。研究證明，抑制IL-6 過度分泌可增加BTBR 小鼠大腦皮層突觸神經(jīng)元谷氨酸釋放，可能對ASD 患者異常社會(huì)行為有選擇性治療作用，為ASD治療提供了新的免疫學(xué)思路［6］。

2 免疫細(xì)胞亞群異常

2.1 T 淋巴細(xì)胞亞群異常 多項(xiàng)研究證實(shí)，ASD 患者體內(nèi)普遍存在T 淋巴細(xì)胞異常。ASHWOOD 等［7］2011 年發(fā)現(xiàn)，ASD 患者CD3+、CD4+和CD8+T 細(xì)胞表達(dá)活化標(biāo)志CD134 和CD25 頻率顯著降低，且評估了70 例ASD 患兒與35 名年齡匹配的正常發(fā)育對照組循環(huán)血細(xì)胞數(shù)量和表型的差異，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，ASD 組一些細(xì)胞激活標(biāo)志物，包括T 細(xì)胞上的HLA-DR 和CD26，以及B 細(xì)胞上的CD38 水平均顯著升高［8］。2019 年一項(xiàng)研究也證實(shí)，ASD 患兒外周血Th17細(xì)胞表達(dá)明顯增高，而Treg細(xì)胞及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Foxp3）和細(xì)胞因子（TGF-β 和IL-10）水平卻明顯下調(diào)［9］。

研究者們評估了BTBR 小鼠外周免疫器官（脾臟、腸系膜淋巴結(jié)和外周血）中的免疫細(xì)胞類型和比例，發(fā)現(xiàn)BTBR 小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD8+T 細(xì)胞數(shù)明顯多于B6 小鼠，且外周血和腸系膜淋巴結(jié)中CD4+T 細(xì) 胞 數(shù) 和 比 例 也 明 顯 升 高［5］。BAKHEET等［10］研究發(fā)現(xiàn)，與B6 對照組相比，BTBR 小鼠CD4+T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 表達(dá)較低，而RORγt、T-bet 和GATA-3 水平較高。BTBR 小鼠與ASD 患者體內(nèi)存在相似的T 細(xì)胞異常，這些變化可能參與了ASD 病理過程。降低BTBR 小鼠外周和腦內(nèi)Th17 免疫應(yīng)答（CD4+T細(xì)胞中STAT3、RORC、IL-17A和IL-23R表達(dá)）可明顯改善BTBR小鼠ASD樣癥狀［11］。

2.2 M1型巨噬細(xì)胞偏斜 巨噬細(xì)胞是天然免疫的重要組成部分，巨噬細(xì)胞在體內(nèi)可能發(fā)生經(jīng)典的M1型活化和替代的M2型活化。M1型巨噬細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子，細(xì)胞免疫效應(yīng)增強(qiáng)，產(chǎn)生高水平的IL-12和低水平的IL-10。相反，M2 型巨噬細(xì)胞具有更高的吞噬活性，釋放的IL-12 水平很低，同時(shí)產(chǎn)生大量IL-10 和TGF-β［12］。而ASD 患者體內(nèi)促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-12、IFN-γ）表達(dá)增加，抗炎細(xì)胞因子（IL-10、TGF-β1）表達(dá)減少，說明患者可能處于過度免疫狀態(tài)［13］。研究者在BTBR 小鼠中也發(fā)現(xiàn)類似反應(yīng)，暴露于脂多糖后，與C57小鼠相比，其巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-12 顯著增多，而IL-10 則明顯減少，提示BTBR 小鼠體內(nèi)存在明顯的M1 型巨噬細(xì)胞偏斜，且M1 型巨噬細(xì)胞因子產(chǎn)生增加與小鼠嚴(yán)重行為損傷有關(guān)［14］。此外，M1 型巨噬細(xì)胞極化與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病有關(guān)，包括多發(fā)性硬化和阿爾茨海默病［15］。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，高鹽可導(dǎo)致M1 型促炎巨噬細(xì)胞過度活化，M2 型調(diào)節(jié)性巨噬細(xì)胞下調(diào)，提示母體高鹽攝入與子代ASD發(fā)生有關(guān)［16］。

2.3 腦區(qū)免疫細(xì)胞異常 雖然大腦被認(rèn)為擁有“免疫特權(quán)”，但過去十年，外周炎癥通過多種機(jī)制影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的現(xiàn)象越來越明顯。小膠質(zhì)細(xì)胞約占大腦細(xì)胞的10%，起常駐免疫哨兵作用，是大腦炎癥的關(guān)鍵細(xì)胞參與者。據(jù)報(bào)道，與對照組相比，ASD 患者額島葉和視皮層小膠質(zhì)細(xì)胞密度提高，且整個(gè)大腦皮層都可能存在這種變化［17］。與人類相似，2019 年一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，BTBR 小鼠比C57 小鼠海馬中激活了更多小膠質(zhì)細(xì)胞［18］。同時(shí)，研究者在BTBR 小鼠丘腦后外側(cè)核、海馬裂和第三腦室的血管周圍觀察到大量肥大細(xì)胞，推測肥大細(xì)胞有侵入腦實(shí)質(zhì)的趨勢。大腦中小膠質(zhì)細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞數(shù)也明顯高于B6小鼠［5］。這些發(fā)現(xiàn)為BTBR 小鼠大腦炎癥發(fā)生提供了依據(jù)。

3 IgG水平異常

研究表明，ASD 患者大腦和外周均存在持續(xù)性炎癥反應(yīng)［19-20］。BTBR 小鼠與ASD 患者發(fā)生了極為相似的免疫炎癥變化，與B6小鼠相比，BTBR小鼠外周血IgG及腦反應(yīng)性IgG（抗腦抗體Abs）表達(dá)明顯上調(diào)。對神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體是自身免疫性神經(jīng)系統(tǒng)疾病的主要特征之一。研究者用ELISA測定了BTBR 小鼠大腦區(qū)域IgG 沉積量，發(fā)現(xiàn)BTBR小鼠大腦中IgG 含量明顯高于B6 小鼠，且黑質(zhì)和海馬差異較為顯著［5］。此外，BTBR 小鼠血清IgG1、IgG2b、IgG3水平也明顯高于社會(huì)化FVB 小鼠，導(dǎo)致其IgG1/IgG2b升高。BTBR 小鼠全腦勻漿中腦反應(yīng)性IgG 含量也高于FVB 小鼠，紋狀體和黑質(zhì)區(qū)最為明顯［21］。而BTBR小鼠高水平的IgG和抗腦抗體（Abs）并非由于其分泌IgG 的B 細(xì)胞增加所致，BTBR 小鼠B細(xì)胞比例明顯低于B6小鼠［22］。

4 母體免疫激活（maternal immune activation，MIA）

盡管ASD 患病率不斷升高，但病因仍不清楚。雖然遺傳因素在ASD 病因中起重要作用，但環(huán)境影響，尤其是在妊娠期，母體環(huán)境變化也可促發(fā)ASD。流行病學(xué)研究表明，懷孕早期母體免疫激活（母體感染）與胎兒ASD 患病風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)［23］。據(jù)報(bào)道，妊娠中期升高的趨化因子和炎癥細(xì)胞因子水平與兒童ASD 高度相關(guān)［24］。將兩個(gè)自交系（即C57 和BTBR）的懷孕母鼠暴露于病毒模擬多聚肌苷酸（poly I：C）中，發(fā)現(xiàn)BTBR 小鼠MIA 效應(yīng)比C57 小鼠更為明顯，幼鼠超聲發(fā)聲行為增加，重復(fù)理毛和掩埋行為更嚴(yán)重，且產(chǎn)生更多的IL-6、IL-17、IL-10 和TNF-α。研究表明，遺傳傾向（BTBR 種系）和環(huán)境因素（感染）協(xié)同作用導(dǎo)致的行為損傷比任意一個(gè)因素導(dǎo)致的更嚴(yán)重，因此，ASD 患者的復(fù)雜行為模式可能是遺傳、環(huán)境等因素疊加所致［25］。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，將BTBR 胚胎移植到健康的B6 雌鼠可改善BTBR幼崽社會(huì)行為，而把B6胎鼠胚胎移植到BTBR母鼠，以及把從BTBR 血清中純化的IgG 注射到B6妊娠母鼠，均會(huì)導(dǎo)致幼鼠社會(huì)化行為缺陷［26］。此外，其他MIA 模型后代也表現(xiàn)出與ASD 患者相似的行為缺陷和類似BTBR 小鼠的免疫失調(diào)，提示免疫系統(tǒng)與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)［27］。

5 小結(jié)

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，ASD 患者普遍存在免疫系統(tǒng)異常，包括大腦持續(xù)性炎癥反應(yīng)、外周血炎癥因子水平升高、腦特異性自身抗體增加和免疫細(xì)胞功能改變。這些免疫失調(diào)與ASD 核心特征的行為損傷增加相關(guān)，尤其是社會(huì)交往和溝通缺陷［28］。BTBR 小鼠作為目前描述最多的ASD 動(dòng)物模型之一，與ASD 患者具有相似的母體免疫異常和體內(nèi)免疫水平紊亂，為ASD 研究提供了可能，解決了由于機(jī)制模糊而導(dǎo)致ASD建模困難的問題。

BTBR 小鼠具有多個(gè)與ASD 患者相似的行為學(xué)和免疫學(xué)特征，研究BTBR 小鼠的免疫異常有助于理解其在行為異常發(fā)展中的作用，為ASD 臨床治療提供了免疫學(xué)思路。未來研究應(yīng)把免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的相互作用以及神經(jīng)炎癥對神經(jīng)發(fā)育障礙的作用結(jié)合考慮，更深入地闡明免疫系統(tǒng)在ASD 發(fā)展中的作用。