BMP4 抑制劑DMH1 對BiSF 法誘導人iPSC 向神經元分化效率的提升作用

劉艷娜，任兆瑞，2，顏景斌，2

1.上海市兒童醫院/上海交通大學附屬兒童醫院上海交通大學醫學遺傳研究所，上海 200040；2.上海市胚胎與生殖工程重點實驗室/國家衛健委醫學胚胎分子生物學重點實驗室，上海 200040

近年來，隨著全球人口的老齡化，神經退行性疾病的發病率逐漸升高。這類疾病的共同病理特征是大腦神經元數量的減少及功能的喪失，最終導致認知障礙、記憶功能喪失及運動感覺功能缺失等神經系統異常的臨床表現［1］。世界衛生組織預測，到2040 年神經退行性疾病的死亡率將超過癌癥，成為世界第二大致死性疾病，它已經嚴重影響人類的生活質量。但是，至今還沒有針對這類疾病的有效治療方案。因此，對神經退行性疾病的發病機制進行研究具有重要的意義。

過去的研究中，神經退行性疾病的研究主要集中在非神經系統的細胞系和模型小鼠中，但是這些細胞或動物模型并不能完全反映人類神經退行性疾病的病理學特征。直到2006 年，YAMANAKA 等［2］通過向體細胞中導入一些轉錄因子，獲得了誘導多能干細胞（induced pluripotent stem cell，iPSC）。iPSC 作為研究人類疾病發病機制和評估治療方法的模型顯示出巨大潛力。

iPSC 的多能性使其可以向多種細胞分化。體外將人誘導多能干細胞（human induced pluripotent stem cell，hiPSC）定向誘導分化為神經細胞，解決了動物和人之間的種屬差異以及人類樣本稀缺性的問題，為體外研究神經退行性疾病的分子機制提供了一種很好的模型。CHANG 等［3］利用BiSF 方法成功將DS-iPSC 誘導為神經元細胞。BiSF 方法中最關鍵的2 種誘導因子分別是6-溴靛玉紅-3'-肟（6-bromoindirubin-3'-oxime，BIO） 和SB431542，二者均有促進神經元的生長和功能恢復的作用［4-7］。眾所周知，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）可以阻斷神經的分化，促進表皮細胞的發育，所以抑制BMP 對神經誘導是非常關鍵的，而BIO 和SB431542 都沒有抑制BMP 的作用。另外，SB431542 對iPSC 分化的作用還存在一定的爭議［8，9］。因此，我們推測BiSF 方法并不能達到最佳的誘導效率。所以本研究在BiSF 方法的基礎上添加了BMP4 抑制劑4-［6-（4-異丙氧基苯基）吡唑并［1，5-a］嘧啶-3-基］喹啉（4-［6-［4-（1-methylethoxy）phenyl］pyrazolo［1，5-a］pyrimidin-3-yl］quinoline，DMH1），通過對BiSF 誘導方法的改進，以期獲得一種更為穩定的hiPSC 向神經元分化的誘導方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 本研究使用的hiPSC購自美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）（ACS-1011），是由正常男性新生兒的包皮成纖維細胞誘導而成。

1.1.2主 要 試 劑DMEM-F12、 Neurobasal、Essential 8 培養基、N-2 添加劑、B27、NEAAs、Matrix、Knockout血清替代物、Geltrex 及2-巰基乙醇購于美國Invitrogen 公司，干細胞專用消化液購于ATCC，SB431542、Y-27632、TritonX-100、牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）及BIO 均購于美國Sigma 公司，重組人堿性成纖維細胞生長因子2

（recombinant human fibroblast growth factor 2， rh-FGF2） 購于美國R＆D 公司，DMH1 購于美國TargetMol公司，4%多聚甲醛購于上海朝瑞生物科技有限公司，細胞計數試劑盒8（cell counting kit-8，CCK-8）購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.1.3 抗體 實驗中用到的一抗：小鼠抗人SSEA1 購于英國Abcam 公司，小鼠抗人neuronal βⅢ微管蛋白（β Ⅲ-tubulin） 購于上海碧云天生物技術有限公司，小鼠抗人nestin 購于美國R&D 公司。二抗：Alexa Fluro 488 標記的山羊抗鼠免疫球蛋白G （immunoglobulin G，IgG） 購于英國Abcam 公司，Cy3 標記山羊抗小鼠IgG 及細胞染色液4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）均購于上海碧云天生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 hiPSC 培養 hiPSC 培養在預先鋪有Geltrex的培養皿中，每日換液，當細胞融合到70%～80%時用干細胞專用消化液消化細胞，接種于鋪有Geltrex的35 mm 培養皿中，置于37 ℃、5% CO2的孵箱中培養。

1.2.2 hiPSC 定向誘導分化為神經元 當hiPSC 融合到75%左右啟動分化，共分為3 組：對照組、BiSF 組及BiSF+DMH1 組。將細胞消化后從Geltrex包被培養皿中分離，在未包被的培養皿中培養2 d，對照組hiPSC 后續不做任何處理，BiSF 組及BiSF+DMH1 組換新的DMEM-F12 培養基（包含20%Knockout 血清替代物、2 mmol 谷氨酸鹽、1 mmol NEAAS 及0.1 mmol 2-巰基乙醇），在孵箱中培養2 d。分化第5 日，更換新的DMEM-F12 培養基（包含2% N-2 添加劑、1 mmol NEAAS 及2 mmol 谷氨酸鹽），同時其中BiSF 組加入神經誘導因子0.5 μmol BIO、10 μmol SB431542及10 ng/mL rh-FGF2，BiSF+DMH1組除了加入上述試劑還要加入0.5 μmol DMH1。培養3 d 后將培養基換為神經元培養基（包含1%N-2添加劑及10 ng/mL rh-FGF2）。培養4 d 后，將細胞消化后轉移到預鋪Matrigel 的培養皿中，培養基中加入2%B27、10 ng/mL rh-FGF2及10 μmol Y-27632。培養5 d后進行后續的鑒定實驗。

1.2.3 免疫熒光 將細胞種在Matrigel 預處理的玻片上，培養1 d 后，棄去培養基，用PBS 洗3 次，加入2 mL 4%多聚甲醛室溫靜置30 min，PBS 洗3 次，每次10 min。吸干PBS，加入0.2% TritonX-100 約1 mL，冰上靜置15 min，PBS 洗3 次，每次10 min。吸干PBS，加入5% BSA，室溫封閉1 h，PBS 洗3次，每次10 min。加入稀釋后的一抗［SSEA1（稀釋比例1∶200）、TRA-1-60 （稀釋比例1∶200）、nestin（稀釋比例1∶200）及βⅢ-tubulin（稀釋比例1∶200）］。一抗4 ℃過夜，第2 日吸去一抗，PBS 洗3 次，每次10 min，加入稀釋后的二抗，二抗Alexa Fluro 488 （稀釋比例1∶500）、Cy3 標記（稀釋比例1∶400），室溫孵育1.5 h。PBS 洗3 次，加入DAPI 室溫孵育10 min，PBS 洗3 次后鏡下觀察。

1.2.4 實時熒光定量PCR 采用Trizol 法抽提細胞的總RNA，用紫外吸收法測定RNA 的濃度，取1 000 ng 的RNA，以Oligo（dT）為引物，用反轉錄酶試劑盒（SuperScript ⅣFirst-Strand Synthesis System）合成cDNA，以稀釋后的cDNA（稀釋比例1∶5） 為模板，每個樣本設3 個復孔，使用SYBR Green Premix ExTaq （TaKaRa） 進行實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）反應，并在ABI7500 實時定量PCR 儀上進行反應及數據的收集。選用管家基因甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）作為內參來衡量目的基因的表達量。引物序列詳見表1。

表1 qRT-PCR檢測相關基因的引物序列Tab 1 Genes and primer sequences used for qRT-PCR analysis

1.2.5 CCK-8 檢測細胞增殖 將具有神經干細胞（neural stem cells，NSC）特性的細胞制成懸液后吸取100 μL 加入預鋪有Matrigel 基質膠的96 孔板，細胞密度為1 000 個/孔，空白對照組只加入培養基，放入5%CO2、37 ℃培養箱內，第2 日向每孔中加入10 μL CCK-8，培養箱內孵育2 h，用酶標儀測定450 nm 處的吸光度。實驗分為BiSF 組和BiSF+DMH1 組，每組5 個平行孔及1 個空白對照孔，共檢測5 d，實驗重復3 次。取5 個平行孔的平行吸光度值減去空白對照組的吸光度值，繪制誘導分化細胞的生長曲線。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0 軟件進行統計學分析并結合GraphPad Prism 5 軟件進行繪圖。定量資料采用x±s表示，2 組間比較采用t檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 hiPSC形態及鑒定

正常hiPSC 通過無滋養層培養基進行培養，并且每日換液。從細胞形態上觀察，hiPSC 的細胞形態與胚胎干細胞（embryonic stem cell，ES）相似，呈典型的克隆狀生長。免疫熒光結果顯示培養的hiPSC 能表達多能干細胞特異性基因SSEA1、TRA-1-60，分別顯示為綠色熒光和紅色熒光（圖1A、B）。

圖1 hiPSC形態及多能性的鑒定Fig 1 hiPSC morphology and pluripotency identification

2.2 鏡下觀察不同誘導方法下細胞形態的變化

當hiPSC 融合到75%時，消化hiPSC，將細胞克隆團轉移到未鋪基質膠的培養皿中，共分為3 個組，分別為BiSF+DMH1 組、BiSF 組，及未處理的對照組。在誘導分化第9 日可以看到BiSF+DMH1 組的細胞團周圍出現大量神經樣梭形細胞（圖2A），BiSF組細胞團周圍出現少量突觸細胞，并且細胞團灰暗不規則（圖2B），而未作任何處理的hiPSC 并未貼壁（圖2C）。這個結果提示，2 種誘導方法均可能將hiPSC誘導分化為神經樣的細胞。

圖2 誘導分化第9日鏡下觀察細胞形態Fig 2 Cell morphologies were observed under microscope on day 9 of differentiation

2.3 免疫熒光檢測NSC相關蛋白的表達

誘導分化第10 日將細胞團消化成單細胞后，接種到Matrigel 預處理的玻片上，培養2 d 后免疫熒光檢測nestin 的表達。結果顯示，2 個誘導組的細胞均表達NSC 特異性蛋白nestin，說明2 種方法都能將hiPSC 誘導分化為表達NSC 特異性基因的細胞，但是熒光強度和細胞形態并沒有很明顯的差異（圖3A）。

隨后，我們比較了2 種方法誘導細胞增殖的情況。將誘導分化的細胞團消化成單個懸浮細胞后，接種到預鋪有Matrigel 的96 孔板中，加入CCK-8 后檢測D（450 nm）值，連續監測5 d。結果顯示，培養后第2 日的BiSF+DMH1 組D（450 nm）值高于BiSF組（0.69±0.02vs0.30±0.01），之后幾日的BiSF+DMH1 組D（450 nm）始終保持比較高的數值，在第5 日差異更加明顯（2.49±0.15vs1.37±0.06）并且差異都具有統計學意義（P=0.000，P=0.002）（圖3B）。這一結果表明，BiSF+DMH1 誘導組的NSC 樣細胞增殖能力明顯強于BiSF誘導組。

2.4 多能性基因及NSC相關基因的表達檢測

為了進一步比較2 種方法將hiPSC 誘導為具有NSC 特性細胞的能力，我們又檢測了干細胞相關基因的表達。qRT-PCR 結果顯示，誘導分化第13 日，2種方法誘導的細胞基本都不表達iPS 細胞特異性的多能基因NANOG及OCT4（圖4A、B），同時檢測了NSC 相關基因nestin 及PAX6的表達情況，結果發現nestin 表達量在BiSF+DMH1 細胞組中明顯高于BiSF組（4.71±0.76vs1.58±0.30），PAX6在BiSF+DMH1組的表達量也明顯高于BiSF 組（3.48±0.74vs0.59±0.22）（圖4C、4D），且差異均具有統計學意義（P=0.019，P=0.011）。這些結果進一步說明了BiSF+DMH1組的誘導效率比BiSF組更高。

圖4 誘導第13日多能性基因及NSC相關基因表達水平比較Fig 4 mRNA expression levels of pluripotency-related genes and NSC-related genes on day 13 of differentiation

2.5 神經元特異性基因表達水平的比較

既然BiSF+DMH1 誘導分化的細胞具有NSC 特性，且細胞的增殖能力比BiSF 誘導組的強，那么用此種方法誘導分化的NSC 樣細胞是否能更加高效地分化為具有神經元特性的細胞呢？隨后，我們將2 組誘導方法獲得的NSC 繼續向神經元分化，并采用免疫熒光檢測分化細胞的神經元特異性微管蛋白βⅢ-tubulin 的表達情況。結果發現，2 組中均能檢測到βⅢ-tubulin 表達陽性的細胞，而BiSF+DMH1 組的紅色熒光強度明顯強于BiSF 誘導組（圖5A）。通過Image J軟件分析也發現BiSF+DMH1誘導組帶有紅色熒光的細胞數量明顯多于BiSF 誘導組（65.82%±5.43%vs30.38%±7.56%），且這種差異具有統計學意義（P=0.003）（圖5B）。

同時，我們采用qRT-PCR 技術檢測2 組細胞中神經元特異性基因MAP2的表達情況，結果發現，BiSF+DMH1 組MAP2的相對表達水平明顯高于BiSF組（3.84±0.59vs1.28±0.22），而對照組hiPSC 幾乎不表達神經元特異性基因MAP2（P=0.006）（圖5C）。上述結果說明，BiSF+DMH1 的誘導方法能夠更有效地將hiPSC 誘導分化為具有神經元特性的細胞。

圖5 神經元特異性標志物的檢測Fig 5 Detection of neuron-specific markers

3 討論

神經退行性病變的研究方法很多，最常用的就是建立小鼠疾病模型。但是人類與動物之間存在著種屬差異，動物模型不能完全真實地反映人體中的情況。而對于神經退行性疾病而言，只有從腦組織中獲取人體組織樣本才具有重要意義，這就使樣本的獲取變得非常困難。因此，神經系統疾病研究的挑戰之一就是找到一個有效的細胞研究系統，它應該具有以下特性：①安全性和可重復性。②不涉及科學倫理問題。③發育起源與神經譜系接近。④可以在體外穩定地擴增，并可以很好地反映疾病的特性。⑤可用于細胞介導療法［10］。iPSC 的出現解決了這些問題，它可以來源于不同類型的體細胞，這些體細胞一般取自于健康人或患者，并通過重編程獲得iPSC，這些iPSC攜帶體細胞中所有的遺傳突變和基因的多態性。利用iPSC 的多能性，將其誘導分化為所需要的細胞，特別是神經細胞，成為研究神經系統病變發生機制的一種重要方法。

將iPSC 定向分化為神經細胞主要分為2 個過程：①將多能干細胞，定向誘導為NSC。②將NSC 誘導分化為終末神經細胞，包括神經元、神經膠質細胞等。常用的誘導方法是將iPSC 懸浮培養后形成擬胚體（embryoidbody，EB），逐步分階段地加入誘導因子，最終達到定向分化的目的。因此，選擇合適的誘導因子在整個分化過程中至關重要。CHANG 等［3］利用BiSF 的方法，在誘導過程中添加了BIO、SB431542 及FGF2，將DS-iPSC 定向誘導分化為神經元，并且在誘導分化的神經元中發現了阿爾茨海默病特有的病變，其出現β-淀粉樣蛋白的聚集及tau 蛋白過度磷酸化。BIO 與FGF2 對細胞的分化都有促進作用。FGF2 是一種活化的成纖維細胞生長因子，可增強脊椎動物和ESC 中的神經分化的能力，有效地將hESC 轉化為NSC［11］。BIO 可以激活Wnt 信號通路［12-13］，在神經分化初始階段的維持OCT4水平，其對神經外胚層的作用至關重要，促進hESC 的神經分化［14］。SB431542 是TGF-β-Smad2/3 通路的特異性抑制劑，可通過Smad2/3調節多能性基因Sox2、Oct4及Nanog的表達［15］，促進ESC 或iPSC 向神經細胞分化［16-18］。但是，有研究指出SB431542 有助于維持ESC 的未分化狀態［19］，并且在小鼠iPSC 生成的過程中，可以代替誘導因子Oct4或者Sox2，加入SB431542 與其他誘導因子，同樣可以成功誘導出iPSC［8-9］。可以看出，SB431542 對iPSC 分化的作用仍然存在一定爭議。所以本文將BiSF 誘導方法進行改進，選擇加入一種BMP 抑制劑來提高iPSC 向神經元分化的誘導效率。

BMP 能夠抑制神經細胞的分化，已是大家所公認的［20-21］。將iPSC 在含有BMP4 上清液的培養基中進行培養，人們發現Smad1 被磷酸化，iPSC 的分化得到有效的抑制。此種方法培養3代后，不僅iPSC的表型可以有效維持，iPSC中的多能基因的表達也未受到影響。同時，這些iPSC 仍有向3 個胚層分化的能力［22］。DMH1 可以直接作用于BMP4，通過抑制BMP4，從而使Smad3 磷酸化降低，達到促進神經分化的作用［23］。前文提到SB431542 也能夠抑制Smad3磷酸化，阻斷TGFβ信號，但是對BMP介導的Smad3磷酸化沒有作用，它對BMP 是沒有直接作用的［24］。所以本研究在BiSF 基礎上加入BMP4 的抑制劑DMH1，希望能夠提高iPSC向神經細胞分化的效率。

我們在懸浮培養hiPSC 2 d 后啟動誘導分化，分化第5 日除了加入BIO 和SB431542，又加入了BMP4抑制劑DMH1。結果發現與BiSF 組相比，加入DMH1后除了細胞形態有所不同（圖2），NSC特異性基因nestin、PAX6的表達量明顯增多（圖4）。Nestin與PAX6都是參與NSC 分化調控的重要基因，二者均在中樞神經發育的一段時間內有表達，之后會被成熟神經細胞所特有的蛋白取代，而它們表達高峰期也恰為NSC 增殖的最旺盛時期［25-27］。因此，我們檢測了這個時期細胞的增殖情況，結果發現BiSF+DMH1 組的細胞增殖能力明顯高于BiSF+DMH1 組（圖3B）。這說明2 種誘導方法均能將hiPSC 誘導分化為具有NSC 特性的細胞，但是BiSF+DMH1 誘導組能更加有效地將iPSC誘導分化為具有NSC特性的細胞。

NSC 具有分裂增殖的能力，在特定的條件下將分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞等不同類型的神經細胞。所以，我們還觀察了2組中的NSC樣細胞分化為神經元的能力。結果發現，2 種方法誘導的細胞均檢測到神經元特異性蛋白βⅢ-tubulin的表達，但是BiSF+DMH1 誘導組中βⅢ-tubulin 陽性的細胞的占比達到65.8%，明顯高于BiSF組（圖5A、B）。而且BiSF+DMH1 組細胞中MAP2表達水平亦高于BiSF 組（圖5C）。這些結果說明BiSF+DMH1 方法誘導出的NSC 樣細胞能夠更高效地分化為具有神經元特性的細胞。

近年來，NSC 移植治療神經退行性疾病方面的研究取得了較大突破。越來越多的研究報告，幾種神經退行性疾病的動物模型在NSC 移植治療后，癥狀都得到一定得改善［28-31］。我們通過對BiSF 方法的改進，顯著地提高了將hiPSC 誘導分化為神經系統細胞的效率，將為神經退行性疾病的研究及治療提供有力的工具。