成纖維細胞的自噬性溶解死亡在增生性瘢痕消退過程中的作用

張 劍，宋 菲，王西樵

上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院燒傷科，上海 200025

增生性瘢痕的發生機制尚未明晰，一直是臨床難以解決的問題，缺乏有效的治療手段。然而值得注意的是，增生性瘢痕臨床上雖未經治療，但多年后可能自行消退，變平變軟。細胞凋亡被認為是增生性瘢痕消退成熟最主要的方式［1］。研究表明，瘢痕中存在嚴重的缺血缺氧環境［2］，而缺血缺氧是細胞產生自噬的重要因素［3］。自噬是細胞在缺氧和缺營養條件下，通過吞噬自身細胞器，消化后獲取能量，維持細胞代謝活動的一種生存方式。生理狀態的自噬促進細胞的存活，長時間自噬或過度自噬可能導致細胞死亡，稱為自噬性死亡。目前大多數研究認為自噬是細胞凋亡的上游啟動因素，高水平的自噬導致細胞凋亡［4-5］。在瘢痕組織的消退過程中，自噬是否是細胞凋亡的啟動因素尚未見文獻報道。此外，相關研究［6-8］還發現另外一種自噬性死亡的方式，它沒有發生細胞凋亡但具有獨特的形態特征，稱為自噬性溶解死亡。因此，本研究重點探索瘢痕消退過程中是否發生了自噬性溶解死亡，以期對未來瘢痕的治療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象、試劑與儀器

1.1.1 研究對象 收集上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院燒傷科2018 年6 月—2019 年6 月燒傷患者16例的瘢痕組織。納入標準［9］：①增生性瘢痕發生時間為3～6 個月，表現為深紅色、厚度增加、瘙癢和疼痛。②消退期瘢痕發生時間為2 年左右，瘢痕厚度變薄，瘙癢和疼痛減輕。排除標準：①瘢痕感染。②瘢痕潰瘍。③瘢痕疙瘩。④糖尿病。⑤高血壓。根據患者增生性瘢痕發生時間分為增生期瘢痕（對照組）和消退期瘢痕（試驗組）2 組，每組8 例。試驗獲上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會批準（批號為2021臨倫審第15號）。所有患者知情同意并簽署同意書。

1.1.2 試劑與儀器 DMEM 培養基、磷酸鹽緩沖液（PBS）、胎牛血清（FCS）均購自美國GIBCO 公司。0.1% Triton X-100、1%牛血清白蛋白、兔抗小鼠二抗、 小鼠抗兔二抗、 3- 甲基腺嘌呤 （3-methlyadenine，3-MA）均購自北京索萊寶公司。微管相關蛋白輕鏈-3（microtuble-associated protein light chain 3，LC3）、低氧誘導因子-1（hypoxia inducible factor 1，HIF-1）、beclin-1、半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）、 caspase-9， BCA 蛋白檢測試劑盒（BCA Protein Assay Kit） 均購自美國Abcam 公司。4'，6'- 二脒基-2- 苯基吲哚（4'，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、單丹磺酰尸胺（monodansylcadaverin，MDC）檢測試劑盒、Calcein/PI熒光染料試劑盒均購自美國Sigma公司。

透射電子顯微鏡（HT7700，日本日立公司），熒光顯微鏡（CFM-500，德國蔡司公司），缺氧培養箱（日本三洋公司），流式細胞儀（FC-500，美國貝克曼公司）。

1.2 方法

1.2.1 透射電鏡觀察瘢痕組織的超微結構變化 瘢痕組織標本用2.5%戊二醛和1%硫酸先后各固定2 h。然后將樣品以30%、50%、70%、80%、90%，100%乙醇梯度脫水，各10 min，然后浸泡、包埋在環氧樹脂中，切片成60 nm 的超薄切片。切片用醋酸鈾酰和檸檬酸鉛溶液染色。在75 kV 常規電壓下，用透射電鏡觀察瘢痕組織內成纖維細胞的自噬情況。

1.2.2 瘢痕組織成纖維細胞分離培養 將取下的2組患者的瘢痕組織立即放入DMEM 培養基中，送到實驗室進行快速處理，碘伏消毒5 min，PBS 沖洗3 次，各5 min。用手術刀去除瘢痕表皮和剩余的脂肪組織，切成1 mm2的組織片。將組織片放入裝有DMEM 和10%FCS 的培養瓶中，并在37 ℃下于5%CO2培養箱中孵育。1 周后，將孵育出的成纖維細胞遷移出組織片。2 周后，成纖維細胞匯合并進行2～6 次傳代，供后續試驗使用。

1.2.3 建立細胞缺氧缺血模型 將匯合率為80%的成纖維細胞置于缺營養和缺氧條件中，參照以往文獻（正常培養條件為10%FCS+21%O2），將培養條件設置為0.5% FCS+0.5% O2，模擬消退期瘢痕內的缺血缺氧環境［7］，分別于0、12、24、48 h 收集成纖維細胞。分別做作電鏡觀察、免疫熒光、活細胞/死細胞檢測等。

另外，同上述成纖維細胞的缺營養和缺氧培養條件，試驗組在24 h 和/或48 h 時相點加入終濃度為30 μg/mL 的3-MA，對照組加入等量PBS，分別于0、12、24、48 h收集細胞，流式細胞儀檢測細胞自噬性溶解死亡和凋亡，Western blotting 檢測HIF-1、beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9的表達。

1.2.4 細胞死亡的測定 研究用Calcein/PI 熒光染料試劑盒檢測活/死細胞，觀察缺氧和缺營養對成纖維細胞死亡的影響。具體步驟為：收集細胞，去上清液，用PBS 清洗細胞3 次；再用PBS 制備細胞懸液（1×105細胞/mL）；取100 μL 染色液加入200 μL 細胞懸液內，混勻；37 ℃溫箱孵育15 min。熒光顯微鏡觀察和拍照，綠色熒光代表活細胞，紅色熒光代表死亡細胞。

1.2.5 免疫熒光檢測 LC3 是公認的自噬標志物，在自噬通路中發揮核心作用，并促進自噬小體的形成。試驗用LC3 和Annexin V 來標記細胞自噬和細胞凋亡。收集成纖維細胞，4%甲醛中固定，PBS洗滌，并在室溫下用0.1% Triton X-100 滲透15 min。用1%牛血清白蛋白（1% BSA）阻斷后，用抗LC3 抗體（工作濃度1∶200）室溫孵育1 h。LC3標記的兔抗小鼠二抗（工作濃度1∶100）在室溫下取樣1 h，然后用DAPI 染色。根據說明書，使用TUNEL 檢測試劑盒進行細胞凋亡檢測。

選取手術室急診患者110例作為研究對象，根據護理方法將其分成兩組。其中，對照組男28例，女25例，年齡34～72歲，平均年齡（53.85±4.72）歲；觀察組男29例，女28例，年齡31～74歲，平均年齡（54.28±4.51）歲。兩組患者的一般資料對比，差異無統計學意義（P＞0.05）。

1.2.6 流式細胞儀檢測 自噬的特征是自噬小體的形成，自噬小體包含一種酸性囊泡細胞器（acidic vesicle organelle，AVO），MDC可用于檢測AVO的形成，作為檢查自噬的發生。因此，為了區分凋亡和自噬性溶解死亡，我們使用MDC 熒光和PI 染色標記自噬性死亡細胞，使用Annexin-V 和PI染色標記凋亡細胞，最后通過計算，自噬性死亡細胞減去細胞凋亡細胞得出自噬性溶解死亡數量。按照說明書，收集和孵育細胞后，用藍色（λ=488 nm）激發光照射細胞，產生紅色熒光（λ=650 nm，胞漿）和綠色熒光（λ=510～530 nm，細胞核），用流式細胞儀檢測凋亡和自噬性死亡細胞的數量。

1.2.7 Western blotting 分析 凋亡一般以caspase 的激活為特征，caspase-3 和caspase-9 表達升高是細胞凋亡的標志。因此，為了研究缺氧和缺營養過程中自噬和凋亡相關基因的變化，我們采用Western blotting檢測HIF-1、beclin-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表達。按照以上培養條件，將細胞接種在75 cm2培養瓶培養。0、12、24、48 h收集細胞，進行蛋白質抽提。采用BCA 蛋白檢測試劑盒進行蛋白定量。SDSPAGE 膠分離蛋白質，轉至硝酸纖維膜上。5%脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃孵育過夜；LC3 工作濃度1∶1 000， beclin-1 工作濃度1∶1 000， caspase-3、caspase-9 工作濃度1∶3 000，GAPDH 工作濃度1∶1 000；TBST 洗膜。二抗室溫孵育l h，TBST 漂洗。然后化學顯影，圖形軟件進行灰度分析。

1.3 統計學方法

應用SPSS 23.0 軟件對研究數據進行統計分析，定量資料以±s表示。符合正態分布組間定量資料采用Student'st檢驗（單尾）。P＜0.05為差異有統計學意義。符合正態分布的多組間定量資料的分析使用One-way ANOVA 檢驗。當P≥0.05 時，認為方差齊性，用LSD 方法進行多重比較。方差不齊時，用Dunnett'st檢驗，進一步做多重比較。

2 結果

2.1 透射電鏡觀察瘢痕組織結果

透射電鏡（圖1）觀察發現：在增生期瘢痕（對照組）內成纖維細胞肥大，內含大量細胞器，可見少量自噬小體，其中部分細胞器被吞噬。在消退期瘢痕（試驗組）內，成纖維細胞顯著縮小，自噬小體顯著增加，大部分細胞質空泡化。隨后，細胞質逐漸消失，細胞膜破裂，分解為珠狀小泡或散在碎片，具有典型的自噬性細胞溶解死亡形態。

圖1 增生期和消退期瘢痕組織自噬的透射電鏡觀察Fig 1 Transmission electron microscope observation of autophagy in proliferative and regressive scar

2.2 成纖維細胞透射電鏡觀察

在0 h 時相點，成纖維細胞的細胞質中有少量的細胞自噬小體。12 h 后，自噬小體和空泡明顯增多，不僅吞噬細胞器，還吞噬細胞質中的膠原。24 h 后，部分細胞質內容物降解，細胞核收縮。48 h后，大部分細胞質內容物消失，細胞質呈空泡化。細胞核凹陷，染色質降解。隨后，可見細胞膜破裂，一些殘留的細胞質內容物流出（圖2）。提示成纖維細胞在缺氧和缺營養條件下發生自噬性溶解死亡。

圖2 不同時間點成纖維細胞的自噬觀察Fig 2 Investigation of autophagy in fibroblasts at different time points

2.3 細胞死亡的測定結果

圖3 成纖維細胞在缺氧和缺營養條件下的細胞死亡情況Fig 3 Cell death of fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.4 免疫熒光結果

圖4 中，紅色為LC3 表達，代表自噬；綠色為Annexin V表達，代表細胞凋亡。結果顯示：0 h時點有少量細胞自噬和少量細胞凋亡（0.14%±0.02%）。在12 h，細胞自噬和凋亡均有增加（0.20%±0.02%）。在24 h，大多數細胞發生自噬，細胞凋亡也達到高峰（0.45%±0.52%，P=0.031）。在48 h，自噬也有高表達，但細胞凋亡率減少（0.33%±0.03%）。結果表明細胞凋亡發生時均有自噬的發生，然而48 h的結果與Calcein/PI 熒光染料試劑盒檢測的死亡細胞不一致，說明在48 h時相點，除了細胞凋亡外，可能還有自噬性溶解死亡。

圖4 成纖維細胞缺氧和缺營養條件下自噬和凋亡共染色結果Fig 4 Co-staining of autophagy and apoptosis in fibroblasts under hypoxia and nutritional deficiency

2.5 流式細胞儀檢測結果

研究分別標記細胞凋亡和自噬誘導的死亡（簡稱自噬性死亡），采用流式細胞儀檢測2 組細胞的數量。結果發現：在0 時相點，細胞凋亡率為0.12%±0.01%，12 h 有所增加，24 h 時顯著升高（0.42%±0.04%，P=0.038），48 h 時略有下降（0.34%±0.03%，P=0.031）；然而，在24 h 和48 h 組加入3-MA 后，細胞凋亡數量明顯降低，表明細胞凋亡是由自噬引起的。

此外，我們利用MDC 和PI 標記檢測自噬性死亡。結果見圖5，在治療前（0 h），有少量細胞死亡發生（2.00%±0.21%），12 h有增加。24 h細胞死亡明顯增加（5.15%±0.47%，P=0.030），48 h 達到高峰（5.98%±0.61%，P=0.020）。而在培養24 h 和48 h 時加入3-MA 后，細胞死亡顯著降低，分別為3.20%±0.31%和4.05%±0.43%（P=0.039 和P=0.041）。研究結果表明，隨著缺氧和缺營養時間的延長，自噬性死亡逐漸增加，并可通過抑制自噬而降低。

圖5 流式細胞儀檢測成纖維細胞自噬性死亡和細胞凋亡Fig 5 Assay of cell autosis and apoptosis by flow cytometry

試驗中，大部分細胞都可以觀察到自噬。自噬是細胞死亡的啟動因子，包括細胞凋亡和自噬性溶解死亡2 種形式。自噬引起的死亡代表總細胞死亡，因此，自噬性溶解死亡數量=自噬引起細胞死亡的總數量-細胞凋亡數量，因此計算得出自噬性溶解死亡的細胞數量為：0 時相點為1.90%±0.25%，12 h 有所增加，24 h 顯著增加（4.73%±0.51%，P=0.038），在48 h 達到高峰（5.64%±0.61%，P=0.021）。加入3-MA 后，細胞死亡數量顯著降低，24 h 和48 h 分別為3.10%±0.35% （P=0.042） 和 4.05%±0.43% （P=0.036）。由此可見自噬性溶解是細胞死亡的主要形式，細胞凋亡是次要的死亡形式。

2.6 Western blotting檢測結果

Western blotting檢測結果見圖6。HIF-1在0 h有一定表達，12 h表達增加，24 h達到峰值。同時beclin-1、LC3和caspase-3、caspase-9表達增加。3-MA抑制后，除beclin-1 外，HIF-1、LC3、caspase-3 和caspase-9 的表達均降低。這是由于3-MA抑制作用于beclin-1的下游，抑制自噬體形成，因此對其表達沒有影響。結果表明，抑制自噬，能夠減少細胞凋亡基因的表達，也說明凋亡是由自噬引起。48 h時，除LC3仍保持高表達外，其余蛋白均顯著下降。這些結果表明，缺氧缺營養延長時（比如48 h），凋亡蛋白表達減少，而LC3維持在高水平，導致自噬性溶解死亡。

圖6 Western blotting檢測細胞自噬和凋亡Fig 6 Assay of apoptosis-and autophagy-related proteins by Western blotting

3 討論

細胞在饑餓、ATP 不足、生長因子缺乏條件下，就可以啟動自噬的發生。自噬是一種在營養缺乏時，消化細胞質細胞器，以實現能量循環的細胞代償過程。生理水平的自噬可促進細胞存活，促進成纖維細胞增殖和瘢痕增生［10］。而過度的自噬可導致成纖維細胞自噬性死亡，促進瘢痕消退成熟。

研究在瘢痕組織和體外實驗均發現細胞自噬性溶解死亡。在早期，自噬體形成過多，自噬體不僅吞噬細胞器，還吞噬膠原纖維，然后大部分的細胞質內容物逐漸消失，細胞質空泡化。細胞核凹陷，染色質降解。在自噬后期，細胞破裂為囊泡樣顆粒。此前在對瘢痕的研究中未見報道。

此外，體外培養成纖維細胞24 h時，一方面透射電鏡下觀察到大量自噬小體形成，同時免疫熒光觀察到細胞凋亡和自噬也達到高峰。另一方面，蛋白表達層面發現beclin-1 和LC3 的表達也明顯增加，凋亡相關蛋白caspase-3 和caspase-9 的表達也明顯增加。但加入3-MA 后，細胞凋亡和自噬性溶解死亡降低，說明2 種細胞死亡形式都是由自噬引起的，阻斷自噬可降低細胞死亡。此外，嚴重缺氧和缺營養培養48 h后，caspase-3 和caspase-9 也下降，伴隨低水平的細胞凋亡，但LC3保持高水平，并伴有高水平的自噬性溶解死亡。與細胞凋亡呈相反趨勢，說明延長缺氧和缺營養時間，產生以自噬性溶解為主的細胞死亡，LC3可能發揮主要作用。

需要指出的是，前期研究表明，線粒體自噬的過程依賴于HIF-1的表達，阻斷HIF-1可以抑制自噬，抑制細胞存活，增加細胞凋亡［11-12］。本研究結果顯示，在缺氧和缺營養早期（6～24 h），其在促進細胞自噬和凋亡方面起主導作用。但在晚期（48 h），HIF-1降低，但自噬仍然保持在較高水平，說明此時HIF-1 不是導致自噬的決定因素，而過度缺氧和缺營養可能就是發生自噬溶解的獨立死亡因素，細胞從“自我代償”進入“自我死亡”。因此在缺氧和缺營養狀態下，自噬性溶解死亡和凋亡可能共同參與了細胞的死亡。

總之，缺氧是增生性瘢痕的微環境特征，自噬貫穿了瘢痕演變的整個過程。在嚴重缺氧和缺營養條件下，除了細胞凋亡以外，自噬性溶解死亡可能是引起瘢痕消退成熟的主要方式，有別于以往瘢痕成熟的“細胞凋亡論”。因此，在未來瘢痕治療過程中，誘導瘢痕中過度自噬和自噬性溶解死亡，可能促進和加快瘢痕的消退和成熟。