聲學調控實體腫瘤理化微環境的機制與研究進展

馮玉儀 柳建華

華南理工大學附屬第二醫院,廣州市第一人民醫院超聲醫學科(廣州 510180)

腫瘤微環境(tumor microenvironment，TME)是一個復雜的系統，在腫瘤的發展和進程中起著重要的作用，對腫瘤治療效果有著顯著的影響，針對TME治療是目前的一個熱點方向。TME由多種細胞(免疫細胞、成纖維細胞、內皮細胞、炎癥細胞和淋巴細胞)、細胞外基質、血管系統、淋巴管系統等組成，腫瘤物理和化學微環境(tumor physicochemical microenvironment，TPCME)異常主要表現為高間質液壓、缺氧、低pH等理化特性[1- 2]，是腫瘤對放化療抵抗的重要原因，也是導致腫瘤進展和轉移的主要因素之一[3]。由于腫瘤實質內TPCME的差異較大，因而對TME的全面了解有助于研發治療癌癥的新方法和策略，目前已有一些針對腫瘤物理微環境的各種成分的研究，例如低頻非聚焦超聲可以增加腫瘤血流灌注、降低腫瘤間質液壓(tumor interstitial fluid pressure，TIFP)、增加藥物穿透血管進入腫瘤實質等[4]。TPCME主要是有以下六個特點：(1)腫瘤血管畸形、形態和功能異常[5]。(2)腫瘤的淋巴管功能異常，淋巴回流受阻[6]。(3)實體腫瘤間質液壓升高，影響藥物和免疫細胞滲入腫瘤實質[7]。(4)細胞外基質異常，腫瘤相關成纖維細胞分泌大量膠原纖維，限制藥物在腫瘤內擴散；成纖維細胞過度牽拉；纖維母細胞稀少或缺失，失去正常調節纖維伸縮的作用，透明質酸含量異常[8]。(5)缺氧，TME缺氧可改變正常微環境的功能，促進腫瘤進展，限制治療效果；腫瘤內大多數區域的氧分壓低于5 mmHg，而正常機體組織中氧分壓大約為30～60 mmHg[9-10]。(6)pH值降低，腫瘤細胞的快速增殖以及腫瘤中不成熟和功能失調的血管的存在會降低氧轉運的效率，導致腫瘤微環境缺氧狀態(<10 mmHg)，使得糖酵解成為主要的供能方式，糖酵解產生的乳酸堆積在TME中，使得TME的pH呈酸性(6.3～6.5)[11]。

聲學調控腫瘤微環境已有頗多研究，包括聚焦超聲、低頻非聚焦超聲聯合微泡、以及聯合攜氧微泡，可以改變腫瘤的血管、細胞外基質的結構，降低腫瘤的間質液壓，改善腫瘤的缺氧等。

1 聲學調控改善腫瘤內部結構

1.1 聲學調控改變腫瘤血管結構

腫瘤的異常脈管系統導致微環境內的改變，其中血管的不充分灌注降低了腫瘤內的氧氣和營養物質的可及性。與正常血管不同的是，實體腫瘤血管是畸形的、囊狀的和混亂的[12]。在小鼠乳腺癌的血管中，腫瘤內皮細胞連接不良，相互重疊生長，并伸入血管腔。此外，在許多不同類型的實體瘤中，腫瘤血管壁有許多開口、細胞間連接變寬、基底膜覆蓋不規則或不足。這些異常特征共同導致血管通透性高、彎曲和擴張，從而在整個腫瘤中產生不均勻的血流和有限的灌注。腫瘤血管形態出現異常，功能受損[13]。腫瘤邊緣微血管密度高于腫瘤中心微血管密度。腫瘤血管形態缺陷導致腫瘤組織血流紊亂、組織缺氧[14]。腫瘤微血管的缺陷特征導致腫瘤容易生長和擴散，干擾放化療的效果。TPCME中的缺氧誘導促血管生成分子的持續產生，如血管內皮生長因子和轉化生長因子[15]。促血管生成因子和抗血管生成因子之間的不平衡導致快速但異常的腫瘤血管形成。通透性的增加導致了血管中蛋白質的滲漏，從而增加了TPCME中的間質膠體滲透壓[7]。升高的TIFP會壓迫血管，加劇缺氧狀態，從而形成惡性循環，高TIFP限制了免疫細胞的浸潤以及治療藥物的滲透。藥物進入腫瘤組織主要依賴于其高通透性和強滯留效應，即EPR效應(enhanced permeability and retention,EPR)，這種效應取決于腫瘤血管系統的滲漏性質和藥物的長時間循環，使得藥物緩慢但不均勻地積聚在腫瘤上。影響EPR效應的因素：(1)腫瘤局部血流；(2)腫瘤血管通透性；(3)血管周圍腫瘤細胞和細胞外基質的結構屏障；(4)TIFP[16]。

TPCME中的異常血管阻礙了腫瘤治療的有效性，使腫瘤血管正常化策略可能增進治療效果[17]，然而，治療后腫瘤細胞增加其他促血管生成細胞因子的表達，補償抑制作用，抗血管生成治療(如抗血管內皮生長因子治療)只能暫時逆轉異常血管，這種短暫的血管正常化被稱為“正常化窗口”，它在不同的腫瘤類型和腫瘤狀態之間是不同的，在“正常化窗口”注入藥物可提高抗腫瘤治療效果[18]。

超聲聯合微泡的治療是近年來超聲治療學的重要進展，該方法主要利用空化效應損傷腫瘤血管壁，從而調控腫瘤的微循環。研究顯示：較低能量的超聲聯合微泡可增加腫瘤血管壁的通透性，開放血—組織屏障，以及增加微循環血流灌注，增加藥物或基因的轉運從而增強療效[19]；較高能量的超聲使腫瘤血管產生較嚴重的損傷，可明顯降低、甚至阻斷局部血流[20]。低頻非聚焦超聲聯合微泡治療通過空化效應改善血管的滲透性，空化效應對血管的作用是直接的、實時的，不需要篩選“正常化窗口”。微泡發生空化可在鄰近的表面(如血管壁/細胞膜)上形成開口，增加粒子穿過自然屏障的滲透性，稱為聲孔效應。微泡的膨脹和收縮可以直接“推”和“拉”附近的表面，并在周圍流體中誘導流體射流和微束[21]。Chen等[22]利用高速成像觀察到空化效應的確切機制包括血管擴張、內陷和液體噴射，而且空化效應對血管的輕微損傷可以改善血管的通透性和藥物的釋放，大多數血管損傷經過一段時間后恢復。空化效應分為穩態空化(非慣性空化)和瞬態空化(慣性空化)。穩態空化包括氣泡的重復收縮和膨脹，與超聲波的交替壓縮和稀疏循環同步，導致附近細胞的局部流體運動和剪切應力增強。瞬態空化指在較高的超聲壓力下，靜脈內微泡的劇烈崩塌引起瞬時微射流，在血管壁上產生機械力，導致血管損傷甚至破裂[23]。

聲壓的選擇是決定超聲治療效果的重要參數之一。低頻非聚焦超聲聯合微泡治療可損傷血管內皮細胞，使內皮細胞間隙增大，血管的通透性和紅細胞向腫瘤間質的滲出增加。Wang 等[24]研究發現3.0 MPa和5.0 MPa治療組治療后即刻出現腫瘤微血管嚴重破壞，管狀結構不可見，彌漫性出血。微血管損傷的程度在0.5 MPa和1.5 MPa治療組較輕，表現為血管擴張、充血和出血。24 h后免疫組化發現，3.0 MPa和5.0 MPa使得腫瘤微血管密度顯著降低。Xiao等[4]在研究中發現1.0 MPa超聲聯合微泡組腫瘤細胞局灶性壞死，微血管充血擴張，血管呈圓形或橢圓形，血管壁結構異常，紅細胞滲漏，改善了腫瘤微環境，增強阿霉素的滲入。

高強度聚焦超聲(high intensity focus ultrasound,HIFU)治療是一種常用的非侵入性治療方法，通過熱效應或機械損傷殺死腫瘤細胞。HIFU對血管系統的破壞作用與微血管口徑、血流速度和超聲特征(發射率、強度和消融時間)有關[25]。Yang等[26]采用大鼠肝臟模型檢測HIFU消融效應(4 MHz,550 W/cm2，4 s)。結果證實HIFU只能破壞200 μm范圍內的腫瘤微血管。HIFU消融破壞腫瘤微循環，提高HIFU腫瘤治療效果。使用兔腹主動脈模型檢測HIFU治療效果(4 MHZ，1 500 W/cm2，5 s)，實驗證實HIFU對大血管安全，因為血管口徑更大，血流速度更快。脈沖高強度聚焦超聲(pulsed HIFU，pHIFU)利用分散在細胞中的微小氣體作為空化核，當達到足夠大的壓力(即空化閾值)時，微小氣體成長為氣泡，因而pHIFU可產生持續且高強度空化效應。Van Leenders等[27]在pHIFU治療后觀察到瘤內出血嚴重，提示腫瘤內微血管破裂，阿霉素隨著血管破裂滲入腫瘤內的量增多，HIFU治療后不僅腫瘤組織發生凝固性壞死，腫瘤血管系統也會出現壞死。Guan等[28]應用HIFU治療兔子宮內膜癌，發現HIFU消融組血管彈性蛋白板分解、彈性蛋白層排列混亂，徹底破壞腫瘤的微循環和含有彈性蛋白的大血管。

微泡還可作為化療藥物、基因等的載體，將化療藥物裝載或結合到直徑小于紅細胞直徑的微泡上，并可在體外發射超聲，使得微泡發生空化效應，空化效應產生的爆破力可使其承載的藥物穿過毛細血管壁進入瘤內[29]。這使得進入瘤內的藥物比單獨注射微泡+藥物的方式有所增多，但并未明顯減輕對正常組織的毒副作用。

1.2 聲學調控細胞外基質結構

細胞外基質(extracellular matrix，ECM)是由膠原、蛋白多糖/糖胺聚糖、彈性蛋白、纖維連接蛋白、層粘連蛋白等多種糖蛋白組成的非細胞三維大分子網絡，基質成分和細胞粘附受體相互結合，形成一個復雜的網絡。細胞表面受體將信號從ECM傳遞到細胞中，ECM調節多種細胞功能，如生存、生長、遷移和分化，對維持正常的細胞功能至關重要[30]。

腫瘤力學改變是許多實體癌的一個特征，反映在間質壓力和壓縮負荷的增加、ECM的硬化以及細胞收縮性和流變性的增強，有助于腫瘤的侵襲，并影響治療效果。

已有多種方法通過重塑ECM來改善腫瘤治療效果，針對ECM膠原成分的治療策略可分為：(1)抑制膠原合成；(2)基質膠原降解；(3)抑制膠原交聯，阻斷膠原相互作用。針對透明質酸治療方法也可分為三類：(1)透明質酸降解；(2)抑制透明質酸合成；(3)阻斷透明質酸信號傳導[31]。聲學調控在細胞外基質方面應用較少，Zhang等[32]研究表明低頻非聚焦超聲治療后(1.0、3.0、5.0 MPa)，兔VX2移植瘤的細胞外基質的膠原纖維結構及數量未見明顯變化。Li等[33]研究發現pHIFU治療后，使用高倍鏡可發現膠原纖維明顯受損，表現為方向性喪失和密集膠原束分離，膠原纖維有磨損的跡象，間質基質的破壞使KPC小鼠胰腺腫瘤中化療藥物阿霉素的濃度增加了4.5倍。體外研究發現治療性低強度超聲可增加包裹的小鼠成纖維細胞(3T3)的膠原和糖胺多糖生成，以及增加人類成纖維細胞的細胞數量，但這一結果僅限于體外，截至目前，仍沒有研究證實在體內治療性的低頻非聚焦超聲可以改變ECM的結構及成分[34]。

2 聲學調控腫瘤微環境理化特性

聲學調控可改變腫瘤結構，腫瘤微環境的各個理化特性以及免疫微環境亦會隨之而改變。

2.1 聲學調控降低IFP，增進治療效果

TIFP升高被認為是治療實體腫瘤的一大障礙，阻礙了藥物進入腫瘤組織間隙。TIFP升高引起各種藥物在腫瘤內的異質性分布，促進腫瘤內缺氧，導致放化療抵抗。實體瘤中TIFP的增加是多因素導致的[7]。TIFP包括液體應力和固體應力，液體壓力包括毛細管的壓力和間質的壓力，兩者都可以進一步細分為靜水壓力和膠體滲透壓。腫瘤內部的非流體元素產生固體應力，包括生長誘導的應力和外部施加的應力。生長誘導的應力是間質中增殖的腫瘤細胞和基質細胞之間的相互作用所施加的壓力。外部施加的應力是生長中的腫瘤與其周圍正常組織之間的相互作用所產生的壓力[35]。

正常組織內間質液壓大約為-1～-3 mmHg，而實體腫瘤TIFP均升高，通常在10～40 mmHg，例如：乳腺癌約30 mmHg，子宮頸癌、轉移性黑色素瘤TIFP均大于20 mmHg。TIFP升高的原因尚不明確，主要有幾下幾點：(1)腫瘤血管系統異常；(2)缺乏功能性淋巴系統，淋巴回流受阻；(3)細胞外基質異常：成纖維細胞缺失以及透明質酸含量增多[36- 37]。目前已有一些藥物和方法可降低TIFP，如針對血管的貝伐單抗(血管內皮生長因子拮抗劑)，針對細胞外基質膠原纖維的膠原酶以及針對透明質酸的透明質酸酶，可增進治療效果[38- 39]。降低TIFP還有一系列的物理方法，如放療、高溫熱療、低頻非聚焦超聲、HIFU、光動力、聲動力療法等。

聲學調控TIFP主要有以下兩種情況：(1)低頻非聚焦超聲聯合微泡治療可以降低TIFP，其機制可能是空化效應改變了血管的通透性，超聲空化還可以栓塞腫瘤血管，減少腫瘤血液供應，以此減少TIFP。此外，慣性空化還可以導致內皮細胞凋亡，間接降低TIFP[40]。Xi等[41]發現通過低頻非聚焦超聲聯合微泡產生的空化作用可以降低TIFP，增加兔VX2腫瘤中聲敏劑的積累，提高聲動力的治療效果。(2)HIFU也可以通過機械效應和熱效應使腫瘤細胞發生壞死的凋亡以及瘤內血管壞損，從而使得TIFP降低[42]。Sassaroli等[43]認為使用HIFU治療后肌肉快速發生腫脹，這種腫脹可能是由于HIFU暴露過程中一些關鍵連接蛋白的損傷導致IFP的最初下降。

腫瘤細胞外基質結構和成分異常也是TIFP升高的主要因素，通過膠原蛋白酶降解膠原蛋白、血小板衍生生長因子抑制膠原信號傳導，地塞米松抑制膠原生成均可以達到降低TIFP的作用，但低頻非聚焦超聲在體內對ECM膠原纖維的數量和結構并無顯著影響，HIFU治療后膠原纖維明顯受損，表現為方向性喪失和密集膠原束分離，此外還有膠原纖維磨損的跡象[33]。

2.2 聲學調控可改善腫瘤內部缺氧環境

實體腫瘤細胞的增殖異常快速，而腫瘤血管生長不足，且存在結構和功能異常，導致腫瘤內部血流的空間和時間異質性。

實體瘤通常包含急性或慢性缺氧的區域，不同區域缺氧程度不同，缺氧對于腫瘤的發生發展是把雙刃劍。一方面，微環境缺氧使癌細胞生長和增殖受到抑制，缺氧被認為是通過降低細胞分裂能力來限制腫瘤生長的一個因素[44]。但另一方面，多項研究發現，降低氧張力使得惡性程度高、適應能力強的細胞存活下來，并誘導多種細胞適應，再次維持和促進癌癥進展，從而誘導癌癥生長。缺氧可通過誘導血管生成、增加糖酵解改變代謝和上調參與細胞存活/凋亡的基因來改善氧合和生存能力[45]。

缺氧細胞也被認為對大多數抗癌藥物具有耐藥性，原因有：(1)缺氧細胞遠離血管，因此沒有充分暴露于某些類型的抗癌藥物中；(2)細胞增殖隨著離血管的距離而減少；(3)缺氧細胞對p53介導的凋亡失去敏感性，這可能降低對某些抗癌藥物的敏感性；(4)某些抗癌藥物(例如博萊霉素)的作用類似于放療。因此，缺氧在腫瘤預后中具有關鍵的負面作用，因為它會導致對標準治療的抵抗，并促進更惡性的表型[46]。

目前，放化療仍然是治療惡性腫瘤的主要手段，腫瘤實質中的氧濃度對腫瘤放療和化療的效果有著很大的影響，對于一些乏氧的腫瘤，放化療的效果十分有限，如胰腺癌[47]。臨床實驗表明，高壓氧治療增加了組織中的氧張力，提高放射治療的效率[48]。Hatfield等[49]研究發現呼吸60%高濃度氧可以改善腫瘤內部缺氧情況，并且使得腫瘤內部免疫抑制狀態轉化為免疫激活狀態，這可能是由于腫瘤內部缺氧情況改善，使得抑制T細胞作用的腺苷生成減少，使原本在缺氧狀態下被抑制的T細胞激活，在呼吸高氧24小時后腫瘤出現消退跡象。

聲學調控腫瘤缺氧微環境有以下幾種方法。Ho等[50]把氧氣包裹在微泡里面，通過超聲外照射使得攜氧微泡中的氧氣在瘤內釋放，通過攜氧微泡治療后，腫瘤缺氧誘導因子HIF-1α表達減少。McEwan等[51]證明了載氧微泡超聲治療中改善了藥物的細胞毒性。楊希等[52]發現，在不同超聲強度條件下輻照脂氟顯微泡，局部化療后腫瘤組織中HIF-1α表達水平均降低。

2.3 腫瘤微環境pH值降低

腫瘤微環境pH值降低與腫瘤微環境缺氧密切相關。在生理、灌流良好的條件下，保持相對穩定，接近血液，正常組織的間質pH值通常在7.3到7.4之間[53]。正常細胞的細胞內pH值略為堿性，約為7.1，細胞外pH值更為堿性，約為7.35。差異似乎很小，但pH值是H+(質子)濃度的對數表達式，因此，pH值相差0.25意味著質子濃度相差很大[54]。

酸性的腫瘤微環境與缺氧微環境類似，可以產生具有更多惡性表型的癌細胞群。在基因型沒有改變的情況下，對環境脅迫(如缺氧和酸中毒)的適應可以改變蛋白質的表達模式，從而促進細胞能力的獲得，例如導致治療抵抗。在此條件下，最適合生存的癌細胞或進化成最適合生存的癌細胞擴展為優勢癌細胞群。因此，通過改變腫瘤微環境中的酸化程度，將癌細胞可侵襲性和治療抵抗力降至最低[55]。

考慮到腫瘤微環境在細胞間相互作用方面的復雜性以及曲折的細胞外空間的擴散障礙，在模擬實體癌組織的幾何形狀和結構組成的實驗制劑中，需要對酸堿調節及其后果進行研究。

基于腫瘤內的酸性微環境，學者們設計了pH響應性的藥物、光敏劑、納米平臺，使得這些藥物可以靶向發揮作用，而對pH正常的組織無作用[56- 57]。張麗等[58]構建一種能在酸性環境下高效釋藥的雙配體pH敏感阿霉素前藥-微泡復合物，超聲輻照可使復合物分散均勻、粒徑減小，有助于藥物進入腫瘤組織并在腫瘤酸性環境中釋放，提高其體內抗腫瘤能力。pH調節在癌癥治療中的研究仍處于起步階段，這一領域還有很多工作要做。聲學調控腫瘤微環境缺氧的同時，腫瘤微環境中的pH也會隨著變化，這一方面還有待驗證[58]。

3 展望

TPCME中各組分之間相互影響，互為因果。如血管系統的異常加重了缺氧，而缺氧又導致血管內皮生長因子分泌增多，促使形成更多異常的血管。聲學調控腫瘤微環境各個組分已經在藥物遞送系統上研究頗多。通過空化效應引起細胞膜產生聲孔效應來提高基因轉染效率亦是當前較為熱門的研究之一。通過超聲聯合微泡作用于TPCME不僅改變了其結構及理化特性，同時也改變了其免疫微環境等。通過聲學調控改變腫瘤微環境中這些異常的因素，達到治療腫瘤乃至增強腫瘤的治療效果值得深入研究。目前，免疫檢查點抑制劑(PD-1、PD-L1、CTLA- 4)、嵌合腫瘤抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)是當前腫瘤免疫的研究熱點。盡管CAR-T已經在血液腫瘤治療方面取得了巨大成功，但是在實體瘤的應用上面舉步維艱，很大一部分原因在于實體腫瘤特殊的微環境使得CAR-T細胞難以進入腫瘤組織內發揮作用。能否以聲學調控改善腫瘤微環境增加CAR-T細胞等免疫細胞的浸潤，需要我們進一步驗證。