抗生素磺胺嘧啶和磺胺甲惡唑在土壤中的淋溶行為研究

胡雙慶，張 玉,2，沈根祥*

1.上海市環境科學研究院，國家環境保護新型污染物環境健康影響評價重點實驗室，上海 200233

2.華東理工大學，上海 200237

抗生素具有抑制或殺滅細菌的作用，被廣泛用于人類和動物的疾病預防與治療，也被作為營養物質的替代品用于飼料添加劑中，從而促進動物生長[1-3].但是，多數抗生素不能被人體和動物完全分解與吸收，會以母體化合物或代謝產物的形式存在于排泄物中，如在糞便和尿液中檢出率為75%～90%[4].農業生產上畜禽糞污還田在多數國家都較常見，通過施用糞便有機肥或糞尿污水灌溉的方式，殘留的抗生素也會進入農田土壤，危及微生物活性及其生態功能，進而影響微生物參與生態系統的過程，同時從分子遺傳水平上改變環境中微生物的群落結構，致使致病細菌產生耐藥性[5-6].殘留在環境中的抗生素會在各級生物間累積放大，并通過食物鏈進入人體[7-9]，對生態環境和人類健康造成潛在威脅[10].

在眾多抗生素中，磺胺類藥物(sulfonamides，SAs)因其價格低廉、藥效好、毒性小、適用性強等優點，常被用于畜禽養殖業[11].我國畜禽養殖業中SAs用量較大，且使用量逐年遞增，Zhang 等[12]研究發現，2013 年豬、雞養殖過程中使用的11 種SAs 總量分別達3 520 和2 450 t.磺胺嘧啶(sulfadiazine，SDZ)和磺胺甲惡唑(sulfamethoxazole，SMX)是2 種常用的典型SAs，它們在環境中的檢出率較高且殘留量較大[12-14].與其他抗生素相比，SDZ 和SMX 的正辛醇-水分配系數較小且吸附能力較弱[15]，容易通過雨水沖刷、浸泡和滲濾等作用逐漸釋放，并隨水以可溶態在土壤中向下垂直遷移并污染地下水環境.

目前，對于農藥和重金屬在環境中的移動性已開展大量研究，但對于抗生素在土壤中的淋溶行為的研究較少，對其進行系統性和規律性探討的研究較為鮮見[16-19].抗生素在環境中的垂直遷移性取決于自身、土壤理化性質以及環境條件等.因此，該研究通過模擬土壤柱淋溶試驗，研究了2 種典型磺胺類抗生素?SDZ 和SMX 在不同表層土含量、淋溶液pH和有機質(即考慮糞便作為肥料進入土壤)影響下各土柱剖面的殘留水平，并采用地下水污染指數表示抗生素淋溶遷移性的大小，預測其對地下水的潛在污染風險，以期為磺胺類抗生素的環境行為分析和生態風險評價提供科學依據.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 抗生素

2 種目標抗生素SDZ 和SMX 的分子結構和基本理化性質如圖1 和表1 所示.SDZ 和SMX 均為酸堿兩性分子，既有呈弱堿性的芳香伯胺，又有顯弱酸性的磺酰氨基.pH 越低，SDZ 和SMX 陽離子形態占比越多；隨著pH 的升高，SDZ 和SMX 以中性分子存在；pH 越高時，SDZ 和SMX 陰離子形態占比越多.

圖1 2 種目標抗生素的分子結構式Fig.1 The molecular structural formulas of 2 target antibiotics

表1 2 種目標抗生素的理化性質Table 1 The physiochemical properties of 2 target antibiotics

1.1.2 供驗土壤和牛糞

供試土壤采自上海市青浦區某水稻田的表層土(0～20 cm)，土壤為青紫泥(人為土綱，人為土成土亞綱，水稻土類，脫潛型水稻土亞類).土壤樣品置于實驗室中自然風干，然后研磨并過篩(<2 mm)以去除石塊、沙礫和植物雜質.過篩后的土壤樣品保存于自封袋中，放置在4 ℃冰箱以備用.供試牛糞采自上海市奉賢區某養牛場，處理和保存方法與土壤樣品相同.供試土壤和牛糞中均未檢出SDZ 和SMX，其基本理化性質如表2 所示.

表2 供驗土壤和牛糞的基本理化性質Table 2 The physiochemical properties of the tested soil and cattle manure

1.1.3 試劑和儀器

SDZ 標準品、SMX 標準品和SMX-13C6內標物購自德國Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸均為HPLC 級，購自美國Tedia 公司；乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸、磷酸氫二鈉、氯化鈣、硫酸、氫氧化鈉均為分析純，購自上海凌峰化學品試劑有限公司.試驗用水為Milli-Q 超純水.SDZ、SMX 和SMX-13C6標準品均用甲醇配制濃度為100 mg/L 的標準儲備液，置于4 ℃冰箱避光保存.EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液的配制：稱取檸檬酸12.9 g，磷酸氫二鈉27.5 g，乙二胺四乙酸二鈉37.2 g，溶于超純水中并定容到1 L，用0.1 mol/L 的硫酸或氫氧化鈉調節pH 至4.00±0.05，需使用當天配制.

抗生素定量檢測分析儀器采用高效液相色譜串聯質譜儀(Xevo TQ-Smicro，美國Waters 公司)，樣品前處理儀器和其他儀器設備包括超聲波清洗器(KQ3200E，昆山市超聲儀器有限公司)、高速離心機(H1850，上海湘儀儀器有限公司)、低溫真空冷凍干燥機(LDG-0.3C，上海昊博低溫真空設備有限公司)、氮吹儀(Anpel 12 通道，上海安譜實驗科技股份有限公司)、pH 計(S220，梅特勒-托多儀器有限公司)、電子天平(TW223L，日本島津公司)、超純水器(Milli-Q，美國Millipore 公司).

1.2 試驗方法

1.2.1 淋溶試驗

參考OECD 土壤柱淋溶試驗方法[20]，按以下步驟進行：在有機玻璃柱(60 cm×5 cm)底部墊一張直徑為5 cm 的濾紙，然后覆蓋一層厚度為1 cm 的石英砂；將自然風干并過篩的供試土壤填入柱中，邊填邊敲打，并適度按壓，以保證柱中土壤均勻、緊實；土壤柱填充完畢后(土柱總高度為50 cm)，計算裝入土量，求得土壤密度，盡量保證每根柱內的土量相同；在土壤表面覆蓋一層厚度為1 cm 的石英砂，再蓋上一張直徑為5 cm 的濾紙；用分液漏斗從土柱頂部加入足量的0.01 mol/L CaCl2溶液，用來飽和土柱(在重力作用下溶液將緩慢往下滲透，當有水滴從土柱底部流出時認為達到飽和)，靜置2 d 使土柱內水分排至接近自然狀態；將添加一定濃度抗生素的污染土(干質量10 g)均勻地平鋪在土柱頂部，再次用0.01 mol/L CaCl2溶液(每天滴加200 mL，模擬100 mm 的日降雨量)淋溶，用錫箔紙包裹有機玻璃柱以防止抗生素光解，保持試驗溫度為20 °C；結束后從取樣孔中取樣(從底部往上每隔10 cm 為一個取樣孔，共5 個)，將采集的土壤樣品冷凍干燥，每份樣品準確稱取5 g (干質量)提取凈化.

為探討不同淋溶條件對抗生素遷移能力的影響，設置了如下試驗處理組：①表層土抗生素含量試驗.表層土SDZ 和SMX 含量分別為4、10、20 mg/kg.②淋溶液pH 試驗.表層土SDZ 和SMX 含量均為4 mg/kg，用0.01 mol/L 的硫酸或氫氧化鈉調節淋溶液pH 分別為3.00、5.00 和7.00.③有機質添加試驗.表層土SDZ 和SMX 含量均為4 mg/kg，根據有機質含量將表層土分為3 種，即土壤組(無牛糞)、混合組(土壤和牛糞質量比為1:1)和糞便組(全部為牛糞).每組試驗均設置3 個平行，淋溶3 d 后，取樣測定每根土柱不同深度的抗生素含量.

1.2.2 樣品提取與凈化

準確稱取5.000 g (干質量)土壤樣品于30 mL 玻璃離心管內，加入10 μL 濃度為5 mg/L 的SMX-13C6內標物與土壤樣品混合均勻，再加入20 mL 甲醇混合EDTA-Mcllvaine 緩沖液(體積比為1∶1)作為提取液，渦旋30 s 后超聲萃取20 min，以3 000 r/min 離心15 min，將上清液轉入500 mL 玻璃燒杯中，再重復提取2 次，合并3 次提取液并用超純水稀釋至500 mL，用玻璃棒攪拌混勻后經0.47 μm 玻璃纖維濾膜(Whatman GF/F)過濾去除細小顆粒狀懸浮物后待用.

依次用5 mL 甲醇和5 mL 超純水活化固相萃取小柱(Waters 公司Oasis HLB 小柱，6 mL/60 mg)，將上述提取稀釋后的水樣以3 mL/min 的速度過柱.上樣完畢后，依次用5 mL 超純水和5 mL 5%的甲醇-水溶液淋洗，再將小柱置于真空狀態下干燥10 min，最后用10 mL 的甲醇以1 mL/min 的流速洗脫目標物至具塞玻璃離心管中.洗脫液在水浴條件(水浴加熱不超過30 ℃)下用氮氣吹干，得到殘渣，再用70%的甲醇-水溶液定容至1 mL，超聲5 min 后，經0.22 μm PTFE 針式濾器過濾后轉移至棕色進樣瓶中，上機待測.

1.2.3 儀器檢測方法

采用Xevo TQ-Smicro 高效液相色譜串聯質譜儀檢測土壤樣品中SDZ 和SMX 的含量.色譜柱為Symmetry C18 柱(50 mm×2.1 mm，5 μm)，流動相A為乙腈，流動相B 為0.5%甲酸-水溶液，梯度洗脫程序：0～1.5 min，流動相中乙腈含量保持在20%；1.5～4.0 min，乙腈含量從20%逐漸增至95%；4.0～6.0 min，乙腈含量保持在95%；6.0～10.0 min，乙腈含量從95%逐漸降至20%.色譜柱溫為35 ℃，流動相流速為0.25 mL/min，進樣量為2 μL.質譜為三重四級桿質量分級器，在電噴霧離子源正離子模式ESI+下選用多反應監測模式MRM 掃描方式進行檢測(SDZ和SMZ 的母離子∶定量子離子∶子離子分別為251.01∶155.94∶64.98 和254.12∶155.96∶91.98).源溫度為150 ℃，錐孔電壓為30 V，毛細管電壓為3.5 kV，脫溶劑氣溫度為500 ℃，脫溶劑氣流速為1 000 L/h，碰撞氣為高純氮氣.

采用內標法，以土壤作為樣品進行加標回收檢測，得到SDZ 和SMX 的加標回收率在79.92%～100.67%之間.其檢測限、標準曲線和加標回收率等如表3 所示，標準曲線的R2均大于0.99，由于儀器檢測方法的分辨率高且檢測限低，因此可用來定量土壤樣品中痕量的目標抗生素SDZ 和SMX.

表3 2 種目標抗生素的標準曲線、檢測限和加標回收率Table 3 The standard curve,detection limits and recoveries HPLC-MS/MS detection of 2 target antibiotics

1.2.4 數據分析

數據為3 次平行試驗的算術平均值，采用SPSS 25.0軟件中Dunnett′s 多重檢驗進行不同處理組之間的差異分析，用不同字母表示顯著性差異(P<0.05，n=3).試驗結果由Origin 8.0 軟件進行擬合.

抗生素的淋溶遷移性通過地下水污染指數(GUS)來模型模擬[21]，計算公式：

式中：GUS 為地下水污染指數；DT50為50%衰減時間，d；KOC為有機碳吸附常數，L/kg.

2 結果與討論

2.1 表層土抗生素含量對SDZ 和SMX 淋溶行為的影響

當表層土SDZ 和SMX 含量分別為4、10、20 mg/kg 時，2 種抗生素的淋溶行為如圖2 所示.由圖2可見，SDZ 和SMX 在土柱各層中的含量隨表層土壤抗生素含量的增加而增加，在供試土壤中這2 種抗生素均呈向下遷移的趨勢，且淋溶結束后上層土壤中抗生素含量明顯高于下層(P<0.05).當表層土抗生素含量為4 mg/kg 時，0～10 cm 土層中SDZ 和SMX 含量平均值分別為39.70 和37.11 μg/kg，分別占施藥量的25.81%和24.12%；10～20 cm 土層中SDZ 和SMX 含量平均值分別為25.20 和23.40 μg/kg，分別占施藥量的16.38%和15.21%；20～30 cm 土層中SDZ 和SMX含量平均值分別為15.70 和13.63 μg/kg，分別占施藥量的10.21%和8.86%；30～40 cm 土層中SDZ 和SMX含量平均值分別為10.50 和9.30 μg/kg，分別占施藥量的6.83%和6.05%；40～50 cm 土層中SDZ 和SMX含量平均值分別為7.60 和6.00 μg/kg，分別占施藥量的4.94%和3.90%.由于SDZ 和SMX 的有機碳吸附常數均較低[14,22]，不易在土柱中保留，短時間(3 d)淋溶就會隨淋濾液流失，由土壤表層遷移至下部，因此推測隨淋溶時間的增加，SDZ 和SMX 會逐漸遷移至土柱下層，甚至到淋出液中.此外，與SDZ 相比，SMX在各層土壤中檢出的含量更低，表明SMX 的淋溶性較SDZ 強.

圖2 不同表層土抗生素含量下SDZ 和SMX 的淋溶行為Fig.2 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns with different antibiotic contents in topsoil

文春波等[23]研究發現，SDZ 在土壤環境中較難降解，因此不同土層SDZ 含量的變化主要由吸附和淋溶引起.由于SAs 吸附性能較差，在土壤中的持久性也較差，易隨雨水沖刷向下遷移[18,24].Rab?lle 等[25]開展了4 種抗生素的土柱淋溶試驗，發現多數藥物都保留在土柱上層，這是因為表層土壤有機質含量比下層高，吸附能力強，從而降低了抗生素向下遷移的能力.

當表層土抗生素含量增至10 和20 mg/kg 時，各層土壤中的SDZ 和SMX 含量分別為表層土抗生素含量為4 mg/kg 時的2 和4 倍，說明隨著表層土抗生素含量的增加，各層土壤受污染的程度增加.但土壤中保留的SDZ 和SMX 含量略低于預測值，可能是在淋溶過程中土壤先快速吸附SDZ 和SMX，優先占據了能量較高的吸附位點，隨著表層土抗生素含量的上升，吸附位點開始減少并逐漸趨于飽和，使得吸附率下降[26].范秀磊等[27]研究也發現，抗生素首先通過疏水分配作用和范德華力快速吸附在微塑料表面，然后再向顆粒內擴散，最后到達吸附平衡，擴散速率常數逐步減小.

2.2 淋溶液pH 對SDZ 和SMX 淋溶行為的影響

考慮酸雨對土壤中抗生素縱向遷移性的影響，設置淋溶液pH 分別為3.00、5.00 和7.00，SDZ 和SMX的淋溶行為如圖3 所示.由圖3 可見：SDZ 和SMX主要保留在0～20 cm 的土層中，當淋溶液pH 為3.00 時，0～20 cm 土層中SDZ 和SMX 含量平均值分別為86.64 和78.64 μg/kg，分別占施藥量的56.31%和51.11%；當淋溶液pH 為5.00 時，0～20 cm 土層中SDZ 和SMX 含量平均值分別為77.88 和72.62 μg/kg，分別占施藥量的50.63%和47.20%；當淋溶液pH 為7.00 時，0～20 cm 土層中SDZ 和SMX 含量平均值分別為62.60 和59.29 μg/kg，分別占施藥量的40.69%和38.54%.到20 cm 以下土層，3 種淋溶液pH 下SDZ 和SMX 的遷移規律大致相同，其含量均低于17 μg/kg，不超過施藥量的11%.土柱中2 種抗生素的含量由上至下均呈逐漸遞減的趨勢，且淋溶結束后上層土壤中的含量明顯高于下層(P<0.05)，與已有研究中其他幾種SAs 的淋溶規律[28]一致.

圖3 不同淋溶液pH 下SDZ 和SMX 的淋溶行為Fig.3 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns irrigated by rainfall of different pH values

淋溶液pH 對土柱中抗生素的遷移能力有重要影響，pH 為3.00 和5.00 時，各層土壤中SDZ 和SMX 的含量均高于pH 為7.00 時，淋溶液pH 越低，上層土壤中保留的抗生素含量越高.由于多數SAs是水溶性的，土壤pH 會影響其離子化形態[29].在極酸性條件下，SDZ 和SMX 多以陽離子形態存在，且pH 越低SDZ 和SMX 陽離子形態占比越多，會發生離子交換或與土壤表面帶負電荷的顆粒結合.pH 為3.00～5.00 時，大部分(超過90%)SDZ 和SMX 以中性分子存在，此時抗生素主要通過疏水性分配作用、氫鍵作用和范德華力被土壤吸附；pH 為6.00～7.00 時，中性分子的量減至10%，陰離子形態的量增至90%，但陰離子形態的抗生素和帶負電荷的土壤顆粒表面會產生靜電斥力，導致吸附作用受到抑制，從而減少吸附量[30-32]，而易于向下遷移.pH 為6.00～7.00 時，盡管中性分子含量較少，大部分抗生素以陰離子形態存在，但吸附量還是相對較大；雖然中性分子對總吸附常數的貢獻明顯大于陰離子形態，但決定吸附總量的是可被吸附的離子形態的量[33].此外，隨著pH 的升高，土壤中有機官能團離解，土壤顆粒表面負電荷增加[32]，也導致土柱中SDZ 和SMX 的吸附量減少，易隨淋溶液流失.

2.3 糞便添加對SDZ 和SMX 淋溶行為的影響

大部分抗生素通過畜禽糞便還田的方式進入農田土壤，該研究設置了3 組添加不同比例牛糞的土柱，其SDZ 和SMX 的淋溶行為如圖4 所示.由圖4 可見：0～10 cm 土層中土壤組(無牛糞)、混合組(土壤和牛糞質量比為1∶1)和糞便組(全部為牛糞)中SDZ 和SMX 含量范圍分別為37.11～39.70、45.09～47.04 和48.83～51.12 μg/kg，分別占施藥量的24.12%～25.81%、29.31%～30.58%和31.74%～33.23%；10～20 cm 土 層中3 組試驗土柱中SDZ 和SMX 含量范圍分別為23.40～25.20、29.99～35.76 和34.59～38.16 μg/kg，分別占施藥量的 15.21%～16.38%、19.50%～23.24%和22.48%～24.80%；而在20～50 cm 土層，3 組試驗土柱中SDZ 和SMX 的遷移規律大體相同，二者含量均低于16 μg/kg，不超過施藥量的10%.

圖4 糞便添加下SDZ 和SMX 的淋溶行為Fig.4 Leaching behaviors of SDZ and SMX in soil columns filled with different manure-applied soils

不論是否添加糞便有機質，3 組試驗土柱不同深度的土層中均檢測到2 種抗生素，并且淋溶結束后上層土壤中抗生素含量明顯高于下層(P<0.05).由于糞便中DOC (溶解性有機碳)含量較高，糞便的添加增強了土壤對抗生素的吸附性[22].在0～20 cm 土層中，混合組和糞便組土壤中SDZ 和SMX 含量均高于土壤組，且糞便含量越多，上層土壤中保留的抗生素含量越高，向下遷移的能力就越弱.但在20～50 cm 土層，3 組試驗土柱中SDZ 和SMX 的含量基本相同.研究[34]表明，豬糞DOM 和抗生素同時引入耕地土時，使得磺胺嘧啶、氟苯尼考、泰樂菌素和諾氟沙星四種抗生素的吸附量明顯上升，這是累積吸附、共吸附、增溶作用與競爭吸附共同作用的結果.土壤表層添加畜禽糞便能夠增強土壤的吸附能力，抗生素向下的遷移性會明顯減小[35]，抗生素在土柱中的淋溶性與其吸附性相反，即在土壤中的吸附性越弱，越容易隨淋溶液到達土柱下層，甚至被淋出土柱到淋出液中.

土壤有機質和pH 是決定土壤吸附能力的兩個重要因素，對土壤中化學農藥[36]以及抗生素的淋溶性也有一定的影響[16,19,37].但由于添加的表層糞便(混合組、糞便組)只占土柱總質量的0.38%和0.76%，加入糞便對總有機質含量影響較小，因此3 組試驗中抗生素在下層土壤中的遷移規律大致相同，即使加入糞便，SDZ 和SMX 在土柱中仍具有較高的淋溶性，能夠遷移至深層土壤.此外，盡管添加糞便使土壤pH 稍有升高，但僅對表層土壤起作用，對抗生素在整個土柱中的遷移規律未產生明顯影響[38].

2.4 SDZ 和SMX 對地下水的污染風險

采用地下水污染指數(GUS)模型評價抗生素對地下水的污染風險，GUS 值越大，說明污染物的遷移性越強，進入地下水的可能性也越大[21,35]：當GUS 值<1.8時，污染物很難發生遷移；當1.8≤GUS 值<2.8 時，一定條件下污染物會發生縱向遷移；當GUS 值≥2.8時，污染物具有較高的遷移性.GUS 是由半衰期(DT50)和有機碳吸附常數(KOC)共同決定的，即抗生素的半衰期越長、吸附能力越強，其在土壤中越易保留，不易出現在淋出液中，反之越易淋出.

已有研究[22,39]發現，SDZ 和SMX 在供試土壤中DT50值分別為8.48 和13.68 d，KOC值分別為1.71 和1.21 L/kg，帶入式(1)得出SDZ 和SMX 的GUS 值分別為3.50 和4.45，均大于2.8，說明這2 種抗生素在土壤中的淋溶遷移性均較強.模型模擬結果與淋溶試驗結果一致，進一步表明SDZ 和SMX 對地下水存在潛在污染風險，并可能威脅環境安全和人體健康，因而需要引起更廣泛的關注.

3 結論

a)畜禽糞污還田會給農田土壤帶來抗生素污染，其中磺胺類抗生素SDZ 和SMX 在淋溶過程中均呈向下遷移的趨勢，但淋溶3 d 時總體來看上層土壤中的含量明顯高于下層土壤.

b)抗生素的淋溶行為受到表層土抗生素含量、淋溶液pH 和糞便有機質添加的影響，表層土抗生素含量增加時，會提高SDZ 和SMX 向下遷移的能力；淋溶液pH 越低或糞便有機質添加量越高時，土壤中保留SDZ 和SMX 的含量就越高，向下遷移的能力就越弱.

c) 通過模型模擬，SDZ 和SMX 的地下水污染指數分別為3.50 和4.45，表明二者在土壤中的淋溶遷移性均較強，對地下水的潛在污染風險不容忽視.