固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定斑馬魚暴露體系4 種雙酚類環境激素的研究

韓 瑩，費雨萌，杜爾登，王明新*，薛銀剛，劉宇軒

1.常州大學環境與安全工程學院，江蘇 常州 213164

2.江蘇省石油化工安全與環保工程研究中心，江蘇 常州 213164

雙酚類化合物(bisphenol analogues，BPs)是一類與雙酚A(BPA)結構相似，通過碳原子或者硫原子和氧原子將2 個羥苯基連接在一起的化合物，具有雌激素毒性、細胞毒性、基因毒性和生殖毒性等[1-3].隨著許多國家和地區出臺法規對BPA 加以限制，雙酚C(BPC)、雙酚F (BPF)、雙酚S (BPS)、雙酚Z (BPZ)等作為BPA 的潛在替代物相繼出現，并且生產和使用量逐步增大[4-5].雖然這些BPs 與BPA 的理化性質相似，但其辛醇水分配系數更高，與BPA 相比具有類似或者更高的雌激素活性[6-8].目前這些BPs 已在多種環境介質中被檢出，預計將有92%的BPs 主要存在于水體中[9-10].BPs 污染水體不僅影響魚類的生長發育，而且有致畸、致癌、致突變作用，致使漁業水域生態環境進一步惡化[11-12].

近年來有關BPs 在環境水體和生物體中的檢出率及濃度的報道越來越多[13-14]，而環境樣品中BPs 的含量較低，并且污染物之間較大的濃度差異以及基質效應對雙酚類環境激素的前處理和檢測方法均提出了較高的要求.目前檢測雙酚類環境激素的方法主要包括高效液相色譜法(HPLC)[15]、液相色譜-質譜法(LC-MS)[16]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[17].前處理技術主要有液液萃取[18]、分散液液微萃取[19]、微波輔助萃取[20]、固相萃取[21]、基質分散固相萃取[22]等.傳統的液液萃取等技術時間、精力、溶劑消耗均較大，而固相萃取操作簡單、吸附劑種類多樣、省時省力省溶劑，已被應用于多種環境介質的檢測領域[23-25].目前使用液相色譜串聯質譜進行水及魚體中雙酚類環境激素定量分析的研究還相對較少[26].

該研究選擇4 種雙酚類環境激素(BPC、BPF、BPS、BPZ)為研究對象，以BPA-13C12和BPS-13C12為內標校正溶液中共存離子的基質效應[27-28]，建立固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜(SPE-UPLC-MS/MS)的定量檢測方法，實現斑馬魚暴露水體中多種雙酚類環境激素的高效、快速測定，以期為生態系統中雙酚類環境激素的檢測及監控提供科學參考和技術支持.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

旋渦混合器〔MX-S 型，大龍興創實驗儀器(北京)股份公司〕主要用于快速攪拌；超聲波清洗機(UC-4600 型，深圳朗杰超聲電器有限公司)用于提取液體中雙酚雌激素；軌道式搖床(HT-20 式，上海滬析實業有限公司)用于混勻；高速離心機(LG20-W 型，北京京立離心機有限公司)用于超聲波提取物的離心；小型超低溫冰柜(DW-86W2 式，浙江捷盛制冷科技有限公司)用于低溫除脂；智能數控自動固相萃取儀(YGC-8 型，鄭州寶晶電子科技有限公司)用于富集提純；水浴氮吹儀(CM-24 型，北京成萌偉業科技有限公司)用于加快蒸發甲醇洗脫液.

雙酚類環境激素的檢測采用三重四極桿質譜儀(TSQ Quantum Access MAX，美 國Thermo Fisher Scientific 公司)配置雙三元高效液相色譜儀(Ultimate 3000 DGLC，美國Thermo Fisher Scientific 公司)；超純水機(UPR 臺上式)購置于四川優普超純科技有限公司；固相萃取柱(Generik H2P)〔200 mg/(6 mL)〕購置于美國Sepax 公司.

甲醇、乙腈均購置于美國Sigma 公司，均為色譜級，試驗用水為超純水.

標準品：BPF (98.0%)購置于上海麥克林生化科技有限公司；BPS (99.0%)、BPC (＞98.0%)、BPZ (98.0%)均購置于上海阿拉丁試劑有限公司.同位素內標BPA-13C12(99.0%)和BPS-13C12(97.0%)均購置于美國Achemtek 公司.

1.2 標準溶液配制

單標貯備液：分別稱取0.1 g 的BPF、BPS、BPC和BPZ，用甲醇溶解并定容至100 mL，配制成1 g/L的標準貯備液，于?20 ℃避光保存.

混標貯備液：分別吸取1.0 mL BPF、BPS、BPC和BPZ 標準貯備液于10 mL 容量瓶中，用甲醇定容，配制成100 mg/L 混合標準貯備液，于?20 ℃避光保存.使用前移取適量混合標準貯備液，逐級稀釋得1 mg/L 混合標準使用液，再用甲醇稀釋成適當濃度的系列標準溶液.

內標溶液：用甲醇稀釋BPA-13C12和BPS-13C12內標溶液配制成1 mg/L 的內標貯備液.分別取BPA-13C12和BPS-13C12內標儲備液，配成各物質質量濃度分別為1、2、5、10、50 μg/mL 的內標混合溶液，于4 ℃避光保存待用.

1.3 樣品制備

1.3.1 樣品采集

以斑馬魚為研究對象，BPF、BPS、BPC 和BPZ的半致死濃度(LC50)的1/100 和1/10 作為暴露濃度[29]，即BPS 濃度分別為15.55 和1.55 mg/L，BPF 濃度分別為0.80 和0.080 mg/L，BPC 和BPZ 濃度均分別為0.20 和0.020 mg/L.斑馬魚體長(2.5±0.50)cm，體質量為0.17～0.30 g.將斑馬魚體表消毒后置于曝氣72 h 的自來水〔pH 為7.74～7.83，硬度為91～108 mg/L(以CaCO3計)，溶解氧濃度為7.45～7.60 mg/L，溫度為(25±0.5)℃，晝夜時間分配為14 h∶10 h〕中，每2 d 喂食1 次，喂食飼料購置于濰坊意品寵物用品有限公司，屬即食脫殼豐年蝦卵，每天投喂魚體質量1%～2%的餌料，喂食后1 h 內手動清除剩余的飼料和魚類排泄物.試驗前馴化斑馬魚至少1 個月，保證自然死亡率小于5%.暴露試驗在1 L 燒杯內進行.設置空白對照組和暴露試驗組，每組2 個平行，每個燒杯放入5 條斑馬魚，暴露8 d，暴露期間不喂食，每天光照結束后2 h 換水，換水前采集水樣，同時測定換水前、后的溶解氧濃度、pH、溫度，保證溶解氧濃度不得小于80%空氣飽和值，溫度穩定在控制范圍內.第8 天在每個燒杯中隨機各取3 條斑馬魚.

1.3.2 樣品前處理

水樣前處理：取500 mL水樣加入40 μL 500 ng/mL 的內標混合液中.將固相萃取柱依次用10 mL甲醇和10 mL 超純水活化，將樣品過柱，用10 mL 含10%的甲醇水溶液(V/V)淋洗去除雜質，用真空泵將柱中的殘余水分抽干，再用10 mL 甲醇溶液洗脫目標化合物，洗脫液用氮氣吹干.最后用V甲醇:V水=1∶1的混合液復溶至1 mL，過膜后轉移到2 mL 進樣小瓶中，供UPLC-MS/MS 分析.

斑馬魚前處理：準確稱取0.1 g 凍干樣品，加入100 μL 500 ng/mL 的內標混合液.用6 mL 乙腈勻漿，超聲萃取30 min，振蕩混合30 min，8 000 r/min 下離心10 min，重復2 次，合并提取液置于?80 ℃除脂48 h.去除脂肪層，將提取液過濾并用超純水稀釋至500 mL過固相萃取柱，后續同水樣前處理.

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為Waters Atlantis T3 Column 色譜柱(2.1 mm×50 mm，3 μm)；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；流速為0.2 mL/min；流動相A 為水，B 為甲醇.梯度洗脫程序：0～0.3 min，85%流動相A，15%流動相B；0.5～9 min，5%～85%流動相A，15%～95%流動相B；9～15 min，5%～85%流動相A，15%～95%流動相B.

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源(ESI)，掃描方式為負離子掃描，選擇反應監控(SRM)；離子源溫度為350 ℃.

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

分 別對BPF、BPS、BPC、BPZ、BPA-13C12和BPS-13C12標準溶液進行分析，確定它們的分子離子峰(m/z)分別為198.7、248.5、254.7、266.9、238.6 和260.3.在較低的能量下對各分子離子進行二級質譜掃描，確定特征離子峰.采用選擇反應監控(SRM)模式進行數據采集，具體參數見表1，標準色譜圖見圖1.

圖1 6 種目標物標準色譜圖Fig.1 Standard chromatograms of the six analytes

表1 4 種雙酚類環境激素及同位素內標的質譜參數Table 1 MS parameters of the four BPs and isotopes

2.2 色譜柱及流動相的選擇

采用Thermo Fisher Accucore? aQ C18 色譜柱(50 mm×2.1 mm，2.6 μm)和 Waters Atlantis T3 Column色譜柱(2.1 mm×50 mm，3 μm)進行試驗[30]，發現C18色譜柱對BPs 的分離效果較差，而Waters Atlantis T3 Column 色譜柱可將6 種物質完全分離，所以最終選用Waters Atlantis T3 Column 色譜柱.

選擇甲醇-水、甲醇-甲酸銨和甲醇-氨水作為流動相按不同比例進行等度洗脫和梯度洗脫，發現流動相為70%甲醇-甲酸銨時BPS 不出峰〔見圖2(a)〕，流動相為70%甲醇-氨水時BPS 不出峰且部分物質的色譜峰拖尾嚴重〔見圖2(b)〕，當流動相為70%甲醇-水溶液時，6 種待測物得到有效分離，但存在拖尾現象〔見圖2(c)〕.將甲醇在流動相中的初始占比降至15%，發現峰形變好，拖尾情況有所改善(見圖1)，這可能是甲醇的容積效應引起.

圖2 流動相分別為甲醇-甲酸銨、甲醇-氨水、甲醇-水時6 種待測物的色譜圖Fig.2 Chromatograms of the six analytes for methanol-ammonium format,methanol-ammonia water,methanol-water as mobile phases

2.3 前處理條件的優化

2.3.1 固相萃取柱的選擇

該試驗探究C18 柱(RNSC500X6X-C18)、Florisil弗羅里硅土柱、親水親脂柱(Waters HLB 柱、Generik H2P SPE 柱)的萃取及回收效果[31-32].由圖3 可知，親水親脂柱對4 種BPs 的萃取效率均較好(69.2%～102.7%).而Florisil 弗羅里硅土柱的萃取效率僅為31.0%～60.16%，C18 柱的萃取效率也僅為53.26%～79.28%.綜合考慮萃取效率和萃取柱使用成本，選取Generik H2P SPE 柱用于BPs 的分離提取.

圖3 不同固相萃取柱對4 種BPs 的回收率對比Fig.3 Recovery performance comparisons of various SPE cartridges for four BPs

2.3.2 洗脫提取溶劑的選擇

BPs 的環境水平較低，需經過濃縮處理來進行測定.該試驗選取甲醇和乙腈進行對比，發現2 種洗脫溶劑的回收率均高于75%，甲醇對BPS、BPC 和BPF 的洗脫效果優于乙腈，乙腈對BPZ 的洗脫效果略優于甲醇，但無明顯差異(見圖4).綜合考慮環境二次污染和試劑成本，選用甲醇作為洗脫溶劑.

圖4 不同洗脫溶劑對4 種BPs 的回收率對比Fig.4 Recovery performance comparisons of various extraction solvents for four BPs

2.3.3 提取溶劑體積的選擇

前處理過程中，提取溶劑體積對提取效率影響較大，該研究比較了3 種不同提取溶劑體積(3、6、10 mL)的洗脫效果，發現當提取溶劑體積為3 mL 時，對BPZ 和BPF 的提取效率較低；當提取溶劑體積為6 mL 時，對BPZ 和BPC 的提取效率較低；當提取溶劑體積為10 mL 時，4 種BPs 的回收率均在90%以上(見圖5).綜合考慮試劑成本和提取效率，提取溶劑體積選擇10 mL.

圖5 不同提取溶劑體積對4 種BPs 的回收率對比Fig.5 Recovery performance comparisons of various extraction solvent volumes for four BPs

2.4 基質效應

基質效應是指樣品中除分析物以外的組分在樣品分析過程中會產生顯著干擾，影響結果的準確性.基質效應(matrix effect,ME)=[(基質匹配校準曲線斜率/純溶劑標準曲線斜率)?1]×100%[33-34].|ME|<20%為弱基質效應，可忽略，無需采取補償措施；20%≤|ME|≤50%為中等程度基質效應，需采取補償措施；|ME|>50%為強基質效應，也須采取補償措施.按照1.2 節方法配制空白基質混合標準工作溶液，以50%甲醇為溶劑配制同濃度的標準溶液，按照上述公式計算ME，BPF、BPS、BPC 和BPZ 的ME 值分別為5.6%、1.5%、15.3%和13.7%，均低于20%，說明該試驗的基質效應基本可以忽略，凈化效果和質譜條件較為合理，有利于準確定量分析.

2.5 方法驗證

2.5.1 標準曲線和檢出限

配制0.5～100 μg/L 的系列標準溶液，在上述色譜條件和質譜條件下進行測定.以待測物與內標物定量離子峰面積之比為縱坐標，樣品中待測物的質量濃度為橫坐標繪制標準曲線.其中，BPF、BPC 和BPZ 以BPA-13C12為內標，BPS 以BPS-13C12為內標，內標添加量均為50 ng.采用空白樣品中添加目標物的方法，確定檢出限(LOD)和定量限(LOQ).由表2 可知：BPF、BPC 和BPZ 在1～100 μg/L 范圍內線性關系良好，相關 系數R2>0.998 0，LOD 為0.12～0.60 μg/L，LOQ 為0.38～1.89 μg /L；BPS 在0.5～100 μg/L 范圍內線性關系良好，相關系數R2為0.999 0，LOD 為0.019 μg/L，LOQ 為0.06 μg/L.

表2 4 種BPs 的線性范圍、線性方程、相關系數、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges,linear equations,correlation coefficient (R2),LOD and LOQ of the four BPs

2.5.2 回收率和精密度

準確稱取0.1 g 魚樣(500 mL 水樣)，加入50 ng(20 ng)內標混合物，分別進行1.5、4.5、15 μg/L BPs下的加標回收試驗.同時做空白對照，每個濃度平行測定6 次，按照1.4.3 節操作步驟對魚樣和水樣進行檢測，計算回收率和相對標準偏差(RSD)，結果如表3 所示.魚樣(水樣)中BPs 的回收率范圍在85.95%～97.45%(91.45%～102.91%)之間，相對標準偏差在4.63%～16.36%(1.47%～11.04%)之間，證明該方法對魚樣(水樣)中BPs 的檢測有較好的重復性和準確性，能夠滿足魚樣(水樣)中BPs 的測定.

表3 斑馬魚及養殖水體中BPs 的加標回收率及精密度(n=6)Table 3 Spiked recoveries and RSDs of the BPs in zebrafish and cultured water (n=6)

2.5.3 穩定性試驗

將15 μg/L 混合標準溶液在常溫下避光保存，每隔2 h 測定其濃度.結果表明，BPF、BPS、BPC 和BPZ 峰面積的RSD(n=13)分別為1.24%、1.08%、0.43%和1.21%，說明在24 h 內溶液濃度無明顯變化.

2.5.4 方法學比較

與其他已有文獻數據相比，固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法有效降低了物質檢出限水平，檢測線性范圍較寬，回收率和精密度較高.如張卓娜等[35]使用固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定尿液中6 種雙酚類及烷基酚類物質，結果顯示，該方法檢出限為0.05～0.60 μg/L，加標回收率為81.4%～112%；吳春英等[36]使用超高效液相色譜-串聯質譜法同時檢測環境水體中27 種環境內分泌干擾物，結果顯示，BPC、BPF、BPS 的檢出限分別為0.18、0.17、0.26 μg/L，超純水中BPC、BPF、BPS 的回收率分別為87.9%、98.2%、99.2%；華永有等[37]使用全自動固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法測定江水中8種酚類內分泌干擾物，結果顯示，加標回收率為80.8%～91.8%，相對標準偏差為2.9%～12%.該研究中的4 種BPs 檢出限為0.019～0.60 ng/L，魚樣(水樣)中BPs 的回收率為85.95%～97.45%(91.45%～102.91%)，相對標準偏差為4.63%～16.36%(1.47%～11.04%)，說明固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法對于環境水體中BPs 的檢測及控制研究具有重要意義.

2.5.5 實際樣品的測定

將斑馬魚暴露于4 種不同濃度BPs 的溶液中，8 d 后對斑馬魚體內的雙酚類環境激素殘留進行測定，結果如表4 所示.由表4 可見：斑馬魚暴露在0.08 和0.79 mg/L 的BPF 溶液中，檢測到魚體內BPF 濃度分別為1.27 和12.52 mg/kg；在1.55 和15.56 mg/L 的BPS 溶液中，魚體內BPS 濃度分別為6.03 和62.33 mg/kg；在0.02 和0.21 mg/L 的BPC 溶液中，魚體內BPC 濃度分別為3.99 和26.44 mg/kg；在0.02 和0.20 mg/L BPZ 的溶液中，魚體內BPZ 濃度分別為20.47和257.65 mg/kg.這4 種BPs 都在短時間內在斑馬魚體內產生富集，并且濃度越高，富集越強，在暴露濃度較大的介質中，魚體內檢測出更高濃度的BPs，并且斑馬魚體內檢測出的BPF、BPS、BPC 在高濃度暴露組基本是低濃度暴露組的10 倍，與暴露濃度呈正相關.因此，有必要圍繞BPs 在水環境中的富集作用及毒性機制開展深入研究.由于每天換水，養殖水體中4 種BPs 的濃度與本體濃度基本相同.該研究與已有文獻報道相比，富集程度略有不同，可能是暴露溶液濃度或者是模式生物的不同所引起的[38].

表4 暴露8 d 后養殖水體和斑馬魚體內4 種BPs 的濃度Table 4 Concentrations of the four BPs in cultured water and zebrafish after exposure 8 d

此外，將固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法進行檢測驗證，分別采集兩類實際景觀水體樣品，在進行1.3.2 節步驟前，所采水樣經0.45 μm 玻璃纖維濾膜過濾[39].試驗設3 組平行，分別測定4 種BPs 濃度，檢測結果取平均值.景觀水體一中檢測出BPF(1.38 ng/L)和BPS(19.76 ng/L)，BPZ 和BPC 未被檢出；景觀水體二中檢測出BPF(9.70 ng/L)、BPS(58.04 ng/L)、BPZ(2.23 ng/L)，BPC 未被檢出.目前，GB 3838?2002《地表水環境質量標準》中對于BPS 還沒有明確的限值要求，參考GB 5749?2006《生活飲用水衛生標準》[40]，認為雖然固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法檢測出的景觀水體中BPS 低于標準限值 (0.01 mg/L)，但仍需要引起重視.

3 結論

a)該研究建立了固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法，并用于檢測斑馬魚暴露體系中的BPC、BPF、BPS 和BPZ.

b)固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法的LOD 為0.019～0.60 μg/L，LOQ 為0.06～1.89 μg/L，BPS在0.5～100 μg/L 范圍內線性關系良好，BPZ、BPF 和BPC 在1～100 μg/L 范圍內線性關系良好.

c)固相萃取-超高效液相色譜-串聯質譜法的加標回收率為85.95%～102.91%，相對標準偏差為1.47%～16.36%，適用于水環境暴露體系雙酚類環境激素殘留的測定技術需求，其檢出限低，靈敏度高，重現性好，具有較好的實用性.