5歲以下喘息患兒ADRβ2、ORMDL3基因SNP與API的相關性研究

王冰潔?王桂蘭?劉翔騰?林嘉鏢?黃娟

通信作者簡介：王桂蘭，醫學博士，主任醫師，碩士研究生導師。南方醫科大學附屬中山博愛醫院兒科主任，兼小兒呼吸內科主任。任中山市醫師協會兒科分會主任委員，中華醫學會變態反應學分會兒童過敏和哮喘學組委員，中華醫學會兒科分會呼吸學組哮喘，感染及間質性肺病協作組委員，中國醫師協會內鏡分會兒童呼吸內鏡專業委員會常委，廣東省胸部疾病協會兒童呼吸與介入專業委員會副主任委員，廣東省臨床醫學會兒童呼吸專業委員會副主任委員，廣東省醫學會變態反應分會兒童過敏及哮喘學組副組長，廣東省臨床醫學學會兒科呼吸專業委員會副主任委員，廣東省基層醫藥學會精準醫學專業委員會常委，粵港澳大灣區兒科基礎呼吸介入聯盟主席，中珠江兒童哮喘協作組組長，另任廣東省級協會委員4項及Pediatric Allergy and Immunology編委。獲得廣東省科學技術獎三等獎1項，中山市科技進步獎一等獎1項、二等獎2項、三等獎1項。主持中山市重大立項2項，主持或參與廣東省立項、中山市重大立項、中山市青年立項、中山市科技局立項、中山市衛生局立項等多個項目。在國外重要期刊、國內核心期刊等發表論文80余篇。

【摘要】 目的 探討腎上腺素能受體β2（ADRβ2）、血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因單核苷酸多態性（SNP）與哮喘預測指數（API）陽性嬰幼兒喘息的相關性。方法 將124例5歲以下喘息患兒分為API陽性組（66例）與API陰性組（58例）。選取兒童哮喘易感基因 SNP位點：ADRβ2 R16G、ORMDL3 rs12603332，采用 TaqMan 探針法對2組患兒進行基因分型，分別比較上述SNP位點在2組間的分布差異。結果 ORMDL3 rs12603332基因型在API陽性組與API陰性組之間的分布差異無統計學意義（χ2 = 2.524，P > 0.05）。ADRβ2 R16G基因型在API陽性組以AA占比最高，AG次之，GG最少;在API陰性組以AG占比最高，GG次之，AA最少;API陽性組AA占比高于API陰性組（χ2 = 25.358，P < 0.05）。ADRβ2基因型AG和GG是API陽性的保護因素，與AA比較，AG、GG是API陽性的概率分別為18.8%和6.4%。結論 ADRβ2 R16G基因型分布在API 陽性與陰性的5歲以下喘息患兒中存在差異，攜帶基因型AA 的喘息患兒或更具進展為哮喘的危險性。ADRβ2或可聯合 API 作為預測兒童哮喘的臨床指標。ORMDL3 rs12603332基因型或與API預測哮喘發生無一致性。

【關鍵詞】 腎上腺素能受體β2基因;血清類黏蛋白1樣蛋白 3基因;單核苷酸多態性;哮喘預測指數

Correlation between single nucleotide polymorphism of ADRβ2， ORMDL3 and asthma predictive index in wheezing children under 5 years old Wang Bingjie， Wang Guilan， Liu Xiangteng， Lin Jiabiao， Huang Juan. Department of Pediatric Respiratory Medicine， Boai Hospital of Zhongshan， Southern Medical University， Zhongshan 528400， China

Corresponding author， Wang Guilan， E-mail： 53046697@qq.com

【Abstract】 Objective To investigate the correlation between the single nucleotide polymorphism （SNP） of Adrenergic receptor beta 2（ADRβ2） gene， Orosomucoid1-like protein 3（ORMDL3） gene and positive asthma predictive index （API） in wheezing children. Methods One hundred and twenty four wheezing children aged under 5 years old were divided into the positive （n =

66） and negative API groups （n = 58）.The SNP loci of ADRβ2 R16G and ORMDL3 rs12603332 of childhood asthma susceptibility genes were selected. Genotyping was performed between two groups by using TaqMan probe assay. The distribution differences of these SNP loci were compared between two groups. Results There was no significant difference in the genotypes of ORMDL3 rs12603332 between the positive and negative API groups（χ2 = 2.524，P > 0.05）. In the positive API group， the proportion of AA was the highest in ADRβ2 R16G genotype， followed by AG and GG. In the negative API group， the proportion of AG was the highest， followed by GG and AA. The proportion of AA in the positive API group was significantly higher than that in the negative API group（χ2 = 25.358，P < 0.05）. AG and GG genotypes of ADRβ2 was protective factors of positive API. Compared with AA， AG and GG were 18.8% and 6.4% of the probability of positive API. Conclusions The genotypes of ADRβ2 R16G between positive and negative API groups are different in wheezing children under 5 years old， and the wheezing children with AA genotype may have a higher risk of developing asthma. ADRβ2 may be combined with API as a clinical indicator for the diagnosis of childhood asthma.There is no consistency between ORMDL3 rs12603332 and API in predicting asthma.

【Key words】 Adrenergic receptor beta 2 gene; Orosomucoid1-like protein 3 gene; Single nucleotide polymorphism;

Asthma predictive index

喘息是兒童較常見的呼吸道癥狀，5歲以下兒童年齡小、難以正確描述癥狀、難以配合檢查，判斷該年齡段患兒喘息病因及是否會進展為哮喘難度大。臨床上常用哮喘預測指數（API）預測喘息患兒未來進展為哮喘的危險性，目前建議API陽性的5歲以下喘息患兒按嬰幼兒哮喘規范治療[1]。

哮喘是兒童時期最常見的慢性呼吸系統疾病，隨著社會經濟的發展，過敏性疾病患兒的數量明顯增多，過敏所致兒童哮喘發病率亦逐年上升，其影響因素復雜，目前認為哮喘基因與環境因素相互作用是引發兒童哮喘的原因[2]。多項研究結果顯示血清類黏蛋白1樣蛋白3（ORMDL3）基因與兒童時期起病的哮喘相關，本課題組的前期研究顯示ORMDL3基因單核苷酸多態性（SNP）rs12603332位點（ORMDL3 rs12603332）與廣東地區兒童哮喘的發生有關[3]。有研究顯示腎上腺素能受體β2（ADRβ2）基因SNP R16G位點（ADRβ2 R16G）與漢族兒童哮喘的發病、嚴重程度及呼吸道重塑有關[4-5]。但ORMDL3及ADRβ2是否與 API 陽性患兒喘息發病相關、是否與 API 在預測哮喘危險性方面具有一致性尚未清楚。鑒于此，本研究對ORMDL3 rs12603332及ADRβ2 R16G與API陽性患兒喘息的相關性進行了探討。

對象與方法

一、研究對象

參考既往研究采用的方法，選取2020年1月至2021年1月于本院小兒呼吸內科門診就診的喘息患兒124例為研究對象并進行分組[5]。納入標準：①年齡 < 5歲;②有咳嗽、喘息癥狀，聽診雙肺聞及哮鳴音;③排除由先天性呼吸道疾病、氣管異物、支氣管淋巴結核、胃食管反流等引起的喘息。按API評估結果將124例患兒分為API陽性組（66例）和API陰性組（58例）。

API陽性是指在過去 1 年內喘息發作 ≥ 4次，具有以下 1 項主要危險因素或2項次要危險因素。主要危險因素包括：①父母有哮喘史;②經醫師診斷為特應性皮炎;③有吸入變應原致敏的依據。次要危險因素包括：①有食物變應原致敏的依據;②外周血嗜酸性粒細胞 ≥ 4%;③與上呼吸道感染無關的喘息[6]。不具有任何1項主要危險因素或2項次要危險因素為API 陰性。

本研究獲本院倫理委員會批準（批件號：2017 B1003）。

二、基因組DNA提取及SNP基因型分析

由于124例患兒均為門診就診者，故于喘息發作期抽取其空腹靜脈血3 mL進行基因組DNA提取及SNP基因型分析，患兒家屬對此知情同意。在抽取的空腹靜脈血中加入0.02 g/mL乙二胺四乙酸（EDTA） 0.4 mL， 用低滲法分離白細胞， 用酚氯仿提取細胞基因組DNA。通過TaqMan探針法（Applied Biosystems）進行基因型分析，使用Premier 5.0引物設計軟件進行引物設計。引物及探針序列為：ORMDL3 rs12603332引物序列，正向5′- GAGACTTTCGTGTGACTATG-3′;反向5′- GCAGGTTATGAAACCACATC-3′;ADRβ2 R16G引物序列，正向5′-GAGTGTTCTGGACAC GTGATTCTTA-3′，反向5′-CAGAGGATCGTGTTTA

TATGAAGAATTAA-3′。PCR循環反應條件：50 ℃

預變性2 min; 95 ℃ 變性10 min， 95 ℃復性15 s， 60 ℃ 延伸60 s， 循環40次;72 ℃后延伸5 min。采用ABI 9700 PCR擴增儀（Applied Biosystems/Life Technologies）進行擴增，然后在ABI 7900實時熒光定量PCR儀（Applied Biosystems/Life Technologies）中進行終點讀板。反應結果經ABI SDS 2.3軟件分析得出基因型。

三、統計學處理

采用SPSS 26.0分析數據。計量資料采用達格斯提諾檢驗法進行正態性檢驗，非正態分布數據用M（P25，P75）表示，組間比較采用Mann-Whitney U檢驗。計數資料用例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。使用二元非條件logistic回歸（進入法）分析API發生的獨立影響因素。P < 0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、API陽性組與API陰性組喘息患兒年齡及性別比較

API陽性組與API陰性組的年齡、性別具可比性（P均 > 0.05），見表1。

二、API陽性組與API陰性組喘息患兒基因型分布比較

ADRβ2 R16G基因型在API陽性組以AA占比最高，AG次之，GG最少;在API陰性組以AG占比最高，GG次之，AA最少，AA在API陽性組中的占比高于API陰性組（P < 0.05）。ORMDL3 rs12603332基因型在API陽性組及API陰性組均以CC占比最高，CT次之，TT最少，基因型在2組間分布無差異（P > 0.05），見表2。

三、API陽性影響因素的二元logistic回歸

上述結果顯示在API陽性及API陰性組間僅ADRβ2 R16G基因型分布存在差異，但既往有研究顯示 ORMDL3基因表達水平與 API之間呈正相關[16]。另外，性別、年齡等可能對API結果存在影響，故將它們共同納入方程進行非條件二元logistic回歸。結果顯示，ADRβ2 R16G基因型AG和GG是API的保護因素，與AA比較，AG和GG是API陽性的概率為18.8%和6.4%。

討 論

目前國內外對5歲以下兒童哮喘的診斷及管理尚無統一標準，5歲以下患兒又因年齡、認知的特殊性無法配合肺功能檢查，兒童喘息病因多樣，5歲以下兒童呼吸道結構尚未發育完善，功能尚不成熟，呼吸道慢性炎癥、呼吸道重塑是否存在仍缺少客觀依據，因此，在臨床工作中，對此年齡段哮喘患兒存在漏診、誤診、無法規范管理等問題[7]。臨床上常用API預測5歲以下反復喘息患兒進展為哮喘的風險，2000年Castro-Rodríguez等[8]提出 API 的概念，將其用于識別可能進展為哮喘的嬰幼兒，其后API在臨床被廣泛應用，目前 API已成為預測兒童哮喘的有效臨床指標，并被寫入兒科教科書及全球哮喘防治創議，5歲以下API陽性患兒被建議接受哮喘規范管理及治療[6， 9] 。

多項研究顯示ORMDL3基因與兒童哮喘相

關[10-13]。本課題組前期研究也顯示ORMDL3 rs12603332與廣東地區兒童哮喘相關，其基因型CC為兒童哮喘發病的危險因素[3]。本研究顯示在API陽性組及API陰性組間ORMDL3 rs12603332基因型分布無差異，提示ORMDL3 rs12603332與API預測哮喘發生或無一致性，這與前述研究結果有差異，不能排除以下因素的影響：①按API結果進行分組可能與臨床實際發生哮喘不完全一致，部分患兒雖然1年內喘息次數 ≥4次，且API陽性，但由于其年齡尚小，呼吸道可塑性大，將來可能不會進展為哮喘;反之，盡管部分患兒1年內只發生1次喘息，其最終卻可能進展為哮喘，尚需要長期觀察方能得出結論。②樣本量不夠大，需要在以后的研究中擴大樣本量進一步探索。

ADRβ2 R16G是ADRβ2基因位于染色體 5q31上的一個重要突變位點，研究顯示其與受體下調失敏、呼吸道高反應、哮喘的嚴重程度以及夜間哮喘的發生相關[14]。本研究顯示ADRβ2 R16G基因型AA在API陽性組中的占比高于API陰性組，這與既往ADRβ2 R16G在中國臺灣地區喘息人群中基因型分布頻率的報道不同，不排除哮喘易感基因具有地域性的可能，另外也可能與各地區特有的經濟狀況、飲食、生活習慣、環境氣候等有關[15]。在預測哮喘危險性方面，此位點與API一致，本研究的logistic回歸分析結果顯示ADRβ2 R16G基因型AG和GG是API的保護因素，與AA比較，AG、GG是API陽性的概率分別為18.8%和6.4%，但由于上文提及的樣本量較小原因，尚需要進一步擴大樣本量深入研究。

綜上所述，ADRβ2 R16G基因型分布在API 陽性與陰性的5歲以下喘息患兒中存在差異，與攜帶AG或GG者相比，攜帶AA的喘息患兒或更具進展為哮喘的危險性，ADRβ2 R16G與API預測哮喘的作用或具有一致性，或可聯合API作為預測兒童哮喘的臨床指標。ORMDL3 rs12603332在預測哮喘方面與 API 的一致性雖未能在本研究得到證實，但由于本研究的樣本量較小，后續仍應進一步擴大樣本量深入探討[16]。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2021-11-30）

（本文編輯：洪悅民）