ATP敏感性鉀通道型先天性高胰島素血癥患兒臨床及遺傳學(xué)特征

惠培培 徐子迪 張琳 曾俏 劉敏 閆潔 吳玉筠 桑艷梅 朱逞 倪桂臣 李榮敏 王杰英

1徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，徐州 221000；2國家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院內(nèi)分泌遺傳代謝科，北京 100045；3北京兒童醫(yī)院保定醫(yī)院內(nèi)分泌科，保定市兒童醫(yī)院，兒童呼吸消化疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，保定 071000

先天性高胰島素血癥(congenital hypein-sulinism, CHI)是一種遺傳異質(zhì)性疾病，是嬰幼兒和兒童時(shí)期頑固性、持久性低血糖的主要原因，其特點(diǎn)是頑固性低血糖及與血糖水平不相稱的高胰島素血癥。隨著研究的不斷進(jìn)展，迄今已發(fā)現(xiàn)了至少14種基因突變與CHI有關(guān)，相應(yīng)地構(gòu)成13種遺傳學(xué)類型[1-3]。ATP敏感性鉀通道型先天性高胰島素血癥(adenosine triphosphate-sensitive potassium channel hyperinsulinism, KATP-HI)是CHI最主要和常見的類型，由編碼磺脲受體 1(sulfonylurea receptor 1, SUR1)的ABCC8基因和編碼內(nèi)向整流鉀通道蛋白6.2(inward rectifying potassium channel,Kir6.2)的KCNJ11 基因突變引起。本研究總結(jié)及分析45例中國KATP-HI患兒的臨床特征及攜帶的致病基因，旨在提高臨床醫(yī)師對(duì)該類型CHI的認(rèn)識(shí)。

資料與方法

一、研究對(duì)象

選取2002年2月至2018年12月間首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院內(nèi)分泌科收治的45例經(jīng)遺傳學(xué)確診為KATP-HI的患兒及其家系為研究對(duì)象。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患兒父母均簽署知情同意書。

二、診療過程

入院后45例患兒均確診為CHI。CHI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]包括高胰島素血癥(血漿胰島素>2 mU/L)、低脂肪酸血癥(血漿游離脂肪酸<1.5 mmol/L)、低酮血癥(血漿β-羥丁酸<2.0 mmol/L)、1 mg靜脈胰高血糖素試驗(yàn)反應(yīng)血糖變化>0.3 g/L。

39例患兒應(yīng)用二氮嗪進(jìn)行試驗(yàn)性治療，以5 mg·kg-1·d-1為起始劑量，每日2～3次口服，根據(jù)患兒病情逐漸增加劑量，最大劑量為15 mg·kg-1·d-1，療程7～10 d。同時(shí)加用氫氯噻嗪利尿1～2 mg·kg-1·d-1，每日2～3次口服，以防止二氮嗪導(dǎo)致的水鈉潴留，并予10%氯化鉀1～2 ml·kg-1·d-1，每日3次口服，以防止氫氯噻嗪導(dǎo)致的低鉀血癥。二氮嗪治療有效的判斷標(biāo)準(zhǔn)[3,5]：患兒禁食12～18 h后血糖水平仍可維持在70 mg/dl(3.9 mmol/L)以上，或者血糖水平降至50 mg/dl(2.8 mmol/L)之前出現(xiàn)高酮血癥(血漿β-羥丁酸>2.0 mmol/L)。如果應(yīng)用二氮嗪最大劑量治療5 d仍不能滿足上述標(biāo)準(zhǔn)，則考慮為二氮嗪治療無效[6]。二氮嗪治療無效或療效不確定的患兒中，18例進(jìn)一步應(yīng)用奧曲肽治療，以5 μg·kg-1·d-1為初始劑量，間隔6 h或8 h皮下注射1次，根據(jù)患兒病情逐漸增加劑量，最大推薦劑量為20 μg·kg-1·d-1。奧曲肽療效的判斷標(biāo)準(zhǔn)同二氮嗪。部分內(nèi)科治療無效的患兒，通過胰腺切除術(shù)進(jìn)一步控制血糖水平。

三、遺傳學(xué)分析

1．血液DNA提取：留取患兒及其父母的乙二胺四乙酸鈉抗凝靜脈血3 ml，使用BloodGen Midi Kit(CWBIO，中國) 提取血中全基因組DNA，操作按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2．二代測(cè)序：采用IDT公司xGen Exome Research Panel v1.0捕獲芯片。首先進(jìn)行文庫制備。(1)基因組片段化，Cavoris儀打斷DNA片段至200 bp左右；(2)末端補(bǔ)平修復(fù)，片段化DNA經(jīng)Klenow Fragment、T4 DNA polymerase和T4 PNK攜帶進(jìn)行補(bǔ)平修復(fù)；(3)3′端腺苷化，應(yīng)用聚合酶體系在補(bǔ)平修復(fù)產(chǎn)物的3′末端加上A堿基；(4)加接頭，應(yīng)用T4 DNA連接酶反應(yīng)體系，在Thermo mixer中室溫反應(yīng)一定時(shí)間將dadpter連接到加“A”的產(chǎn)物；(5)擴(kuò)增，連接產(chǎn)物經(jīng)4～6輪PCR擴(kuò)增；(6)雜交，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與探針混于雜交體系，置65℃雜交60～68 h；(7)洗滌磁珠和洗脫DNA，雜交樣本加入鏈霉素磁珠，孵育后用洗脫液洗脫；(8)洗脫產(chǎn)物擴(kuò)增，洗脫產(chǎn)物經(jīng)10輪LM-PCR擴(kuò)增。然后進(jìn)行Illumina平臺(tái)測(cè)序。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Illumina hisep xten平臺(tái)標(biāo)準(zhǔn)化測(cè)序操作獲取圖像原始數(shù)據(jù)，通過Illumina官方baseball分析軟件BclToFastq進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，并對(duì)突變假陽性進(jìn)行過濾。

3．一代測(cè)序(Sanger法)驗(yàn)證：二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)患兒攜帶ABCC8或KCNJ11基因突變，根據(jù)基因所驗(yàn)證位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，采用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，用ABI 3730XL測(cè)序儀測(cè)序，測(cè)序引物采用原PCR引物；采用DNASTAR軟件進(jìn)行基因序列分析和比對(duì)。參照單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(dsSNP)和千人組基因庫排除非致病性變異，并通過搜索在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、人類基因突變數(shù)據(jù)庫(The Human Gene Mutation Database)、NCBI數(shù)據(jù)庫等明確該突變是否曾經(jīng)報(bào)道過。根據(jù)人類基因組變異軟件Provean、SIFT預(yù)測(cè)基因突變對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)的影響。

四、隨訪情況

對(duì)45例患兒進(jìn)行6個(gè)月～10年的長期隨訪，主要隨訪內(nèi)容包括患兒藥物治療、藥物不良反應(yīng)、術(shù)后轉(zhuǎn)歸、低血糖發(fā)作、空腹血糖及餐后2 h血糖、自行緩解等情況。CHI自行緩解的判斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：采用二氮嗪治療的患兒停止口服二氮嗪至少5 d，空腹18～48 h(依年齡而定)，血糖水平可維持在70 mg/dl(3.88 mmol/L)，或者出現(xiàn)高酮血癥(血漿β-羥丁酸>2.0 mmol/L)。

結(jié) 果

一、臨床特征

45例KATP-HI患兒中男性26例，女性19例。出生體重1.8～5.0 kg，其中正常體重兒22例(48.9%)，巨大兒22例(48.9%)，低出生體重兒1例。發(fā)病年齡為出生當(dāng)日～ 2歲，其中新生兒期發(fā)病34例(75.6%)，1～6個(gè)月發(fā)病8例，>6個(gè)月發(fā)病3例。21例首發(fā)癥狀為抽搐，13例為反應(yīng)弱，2例為多汗，1例為肌張力低，1例為面色青紫，7例無明顯臨床癥狀。1例患兒有低血糖家族史，其姐姐5歲時(shí)出現(xiàn)低血糖癥狀，后診斷為CHI。

二、診療效果

39例應(yīng)用二氮嗪治療的KATP-HI患兒中，12例(30.8%)治療有效，16例(41.0%)治療無效，另外11例患兒因二氮嗪治療出現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)(血小板降低、嚴(yán)重的水鈉潴留、不能耐受的胃腸道反應(yīng)等)或家庭因素而終止二氮嗪治療，故對(duì)二氮嗪療效不明確。

二氮嗪治療無效或療效不確定而奧曲肽治療應(yīng)用的18例患兒，其中13例(72.2%)治療有效，3例(16.7%)治療無效，2例療效不明確。

內(nèi)科治療無效的10例患兒行手術(shù)治療，其中8例術(shù)前行18氟-左旋多巴正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描(18F-DOPA-PET)確定為局灶型病變的患兒行胰腺部分切除術(shù)；2例術(shù)前未行18F-DOPA PET掃描的患兒行次全胰腺切除術(shù)，術(shù)后病理檢查結(jié)果顯示1例為彌散型病變，1例為局灶型病變。

三、遺傳學(xué)分析結(jié)果

45例KATP-HI患兒共發(fā)現(xiàn)52種ABCC8突變及2種KCNJ11突變，且經(jīng)蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)均可能有害或生物學(xué)危害性較高。10例攜帶ABCC8復(fù)合雜合突變(表1)，34例只攜帶ABCC8或KCNJ11單基因突變(表2)；1例男性新生兒出生后1 d發(fā)病，出生體重3.8 kg，血糖2.2 mmol/L，同時(shí)攜帶ABCC8基因(c.1775T>G)和KCNJ11基因(c.374T>C)突變，二氮嗪治療有效。

表1 10例ABCC8復(fù)合雜合突變的KATP-HI患兒臨床特征及預(yù)后

表2 34例ABCC8或KCNJ11基因單突變的KATP-HI患兒臨床特征及預(yù)后

34例攜帶單個(gè)基因突變的患兒中21例突變來自于父親，其中18例應(yīng)用二氮嗪治療，1例有效，7例無效，10例療效不明確；3例突變來自于母親，其中2例應(yīng)用二氮嗪治療，均有效，1例飲食控制血糖正常；新生突變6例，均應(yīng)用二氮嗪治療，3例有效，3例無效；4例突變來源不詳。

四、隨訪結(jié)果

經(jīng)長期隨訪，45例KATP-HI患兒中13例繼續(xù)藥物(二氮嗪或奧曲肽)治療；8例自行緩解，緩解時(shí)間6個(gè)月～2歲，均為ABCC8突變，其中6例為單基因突變，2例為復(fù)合雜合突變；8例行胰腺部分切除治療的KATP-HI患兒，術(shù)后血糖恢復(fù)正常；2例行次全胰腺切除術(shù)的患兒分別于術(shù)后第3年、第4年并發(fā)1型糖尿病；1例頻繁喂養(yǎng)下未出現(xiàn)頻繁低血糖；1例放棄治療；11例失訪；1例因呼吸道感染死亡。

討 論

KATP-HI是CHI最常見類型，是由于ABCC8及KCNJ11基因缺失性突變導(dǎo)致的。KATP-HI患兒發(fā)病較早，多見于新生兒期。既往文獻(xiàn)報(bào)道，新生兒期發(fā)病者約占83%[8]，本研究45例KATP-HI患兒中新生兒期發(fā)病者占75.6%，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致。KATP-HI患兒中巨大兒占比較高，本研究的巨大兒約占48.9%，與文獻(xiàn)報(bào)道的45.3%接近[8]。

二氮嗪是CHI的一線治療藥物，該藥為鉀通道開放劑，能與KATP敏感性鉀通道的SUR1亞單位結(jié)合，使鉀通道處于開放狀態(tài)，從而抑制胰島素的分泌。研究資料顯示，二氮嗪治療對(duì)多數(shù)KATP-HI患兒無效(62.0%～86.8%)，機(jī)制與KATP-HI編碼鉀通道的基因出現(xiàn)不同程度的功能缺失性突變有關(guān)[8-9]。本組39例患兒曾予二氮嗪治療，無效率高達(dá)41.0%，稍低于文獻(xiàn)報(bào)道，考慮與部分患兒療效尚未明確有關(guān)。絕大多數(shù)二氮嗪治療無效的CHI患兒奧曲肽治療效果較好。本組對(duì)二氮嗪無效或療效不確定的18例患兒進(jìn)一步選擇奧曲肽治療，有效率高達(dá)72.2%，與既往文獻(xiàn)報(bào)道一致。

對(duì)內(nèi)科治療無效的CHI患者可考慮行胰腺切除術(shù)。國外文獻(xiàn)建議的手術(shù)指征為內(nèi)科治療無效的CHI患兒或經(jīng)18F-DOPA-PET確定為局灶型病變的患兒[10]。2019年美國的一項(xiàng)研究報(bào)道246例行胰腺部分切除術(shù)治療的局灶型CHI患兒，97%術(shù)后獲得治愈，僅7例仍需要通過藥物控制低血糖。本組8例行胰腺部分切除術(shù)的患兒均獲得治愈，說明局灶型CHI行胰腺部分切除術(shù)有較高的臨床治愈率。次全胰腺切除術(shù)的常見并發(fā)癥主要有反復(fù)低血糖、糖尿病和外分泌功能不全，本組2例行次全胰腺切除術(shù)的患兒均繼發(fā)糖尿病，表明術(shù)前明確病理類型對(duì)手術(shù)方式的選擇及預(yù)后評(píng)估極為重要。

研究顯示， CHI 患兒隨著年齡的增長及其對(duì)胰島素需要量的增加，其低血糖癥狀可有所減輕，部分患兒可自愈。國外研究報(bào)道，約48%CHI患兒的低血糖可自行緩解，且自行緩解的時(shí)間跨度為3個(gè)月～8歲，自行緩解的患兒中約15%是KATP-HI，4%分別為其他類型基因突變[11]。本組8例患兒自行緩解，時(shí)間跨度為6個(gè)月～2歲。說明應(yīng)適當(dāng)延長 CHI 患者的隨訪時(shí)間，對(duì)二氮嗪治療無效的 CHI 患者應(yīng)謹(jǐn)慎選擇手術(shù)治療，從而盡可能減少手術(shù)并發(fā)癥的發(fā)生。

隨著研究的進(jìn)展，迄今已發(fā)現(xiàn)448種ABCC8突變，66種KCNJ11基因突變[12]。攜帶ABCC8基因復(fù)合雜合突變的KATP-HI患兒發(fā)病時(shí)間多較早，組織學(xué)類型均為彌散型病變[1]，少數(shù)患兒對(duì)二氮嗪治療有效，絕大多數(shù)對(duì)奧曲肽治療有效[13-14]。本組10例攜帶復(fù)合雜合突變的KATP-HI患兒中9例曾應(yīng)用二氮嗪治療，僅3例有效，5例無效患兒進(jìn)一步應(yīng)用奧曲肽治療，其中4例有效。提示攜帶ABCC8復(fù)合雜合突變的CHI患者多對(duì)二氮嗪無效，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[13，15]。研究發(fā)現(xiàn)，94%攜帶ABCC8或KCNJ11基因單一雜合隱性突變患兒的胰腺組織學(xué)病變?yōu)榫衷钚停绻蛔冞z傳自父親，則病變類型為局灶型的可能性上升至98%[16]。隱性遺傳的KATP-HI患兒臨床低血糖癥狀多較重，且多對(duì)二氮嗪治療無反應(yīng)。攜帶ABCC8或KCNJ11基因單一雜合顯性遺傳患兒的胰腺組織學(xué)類型多為彌散型，臨床癥狀較隱性遺傳者輕，且絕大多數(shù)二氮嗪治療有效，這與顯性遺傳的ATP敏感性鉀通道有部分功能相關(guān)[16]。本組7例攜帶ABCC8父系遺傳的患兒均為局灶型，均對(duì)二氮嗪治療無效，后行胰腺部分切除術(shù)，術(shù)后隨訪，在無藥物治療下血糖均正常。根據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)、二氮嗪治療情況及組織學(xué)類型考慮這7例患兒為常染色體隱性遺傳，但因未對(duì)胰腺病灶進(jìn)行微衛(wèi)星標(biāo)記分析，暫不能證實(shí)母系11p15.1染色體等位基因的缺失。

既往研究發(fā)現(xiàn)，母系遺傳的攜帶單個(gè)ABCC8或KCNJ11基因突變的CHI患者中巨大兒多見，主要于嬰兒期發(fā)病，臨床癥狀較父系遺傳的隱性突變的CHI患兒輕，多對(duì)二氮嗪治療有效，對(duì)二氮嗪試驗(yàn)性治療無反應(yīng)者可給予奧曲肽，均治療有效，迄今尚未見此類患者行手術(shù)治療。文獻(xiàn)報(bào)道此類患者遺傳方式多為常染色體顯性遺傳，組織學(xué)類型多為彌散型[16-17]。本研究的3例母系遺傳患兒均為巨大兒，其中2例應(yīng)用二氮嗪治療，均有效，1例飲食控制血糖正常，符合文獻(xiàn)報(bào)道的母系遺傳KATP-HI的臨床特征。

新生突變所致的KATP-HI遺傳方式為常染色體顯性遺傳，組織學(xué)類型多為彌散型，部分對(duì)二氮嗪治療無效[13，17]。本研究6例新生突變，均應(yīng)用二氮嗪進(jìn)行治療，其中3例有效，3例無效。無效患兒中1例曾行18F-DOPA PET，結(jié)果顯示為局灶型，后行胰腺部分切除術(shù)治愈，1例予以奧曲肽治療后血糖穩(wěn)定，1例失訪，提示新生突變所致的KATP-HI臨床癥狀輕重不一，局灶型CHI可能有著更為復(fù)雜的遺傳學(xué)機(jī)制。

Rozenkova等[18]曾報(bào)道1例同時(shí)攜帶ABBC8(p.Tyr1293Asp)及KCNJ11(p.Arg50Trp)突變的患兒，突變基因分別來自其父親和母親，足月順產(chǎn)，出生體重4 kg，生后第1天發(fā)病，臨床癥狀較輕，對(duì)二氮嗪無效但對(duì)奧曲肽治療有效，并于2歲半時(shí)自行緩解。本研究也發(fā)現(xiàn)1例同時(shí)攜帶ABBC8(p.L592R)及KCNJ11(p.I125T)突變的患兒，足月順產(chǎn)，出生體重3.8 kg，出生后第1天發(fā)病，對(duì)二氮嗪治療有效。患兒現(xiàn)5歲，仍口服二氮嗪治療，血糖可維持在正常范圍內(nèi)，提示同時(shí)攜帶ABBC8及KCNJ11基因突變的CHI患者發(fā)病均較早，臨床癥狀較輕，且均對(duì)藥物治療有效。

綜上所述，KATP-HI患者發(fā)病多較早，臨床癥狀輕重不一，多數(shù)對(duì)二氮嗪的治療無效，而奧曲肽的療效較好。局灶型病變患者行胰腺部分切除術(shù)治療具有較高的治愈率，次全胰腺切除術(shù)有繼發(fā)糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)，故術(shù)前明確患者的胰腺組織學(xué)類型極為重要。部分KATP-HI患兒有自行緩解的可能，故可以適當(dāng)延長隨訪時(shí)間，謹(jǐn)慎選擇手術(shù)治療。攜帶ABCC8基因復(fù)合雜合突變的KATP-HI患兒發(fā)病時(shí)間早，均為彌散型病變。攜帶ABCC8或KCNJ11單個(gè)基因突變的父系遺傳的KATP-HI患兒，隱性遺傳者的胰腺組織學(xué)類型多為局灶型，臨床低血糖癥狀較重，多對(duì)二氮嗪治療無反應(yīng)；顯性遺傳者的胰腺組織學(xué)類型多為彌散型，臨床癥狀較輕，絕大多數(shù)對(duì)二氮嗪治療有效，這可能與顯性遺傳的ATP敏感的鉀離子通道有部分功能相關(guān)。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明惠培培：論文撰寫、統(tǒng)計(jì)分析；徐子迪、張琳、 曾俏：采集數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)整理；劉敏、閆潔、吳玉筠：分析數(shù)據(jù)；朱逞、倪桂臣：獲取材料支持；桑艷梅：研究指導(dǎo)、論文修改