甲狀腺素在骨髓間充質干細胞成軟骨誘導過程中的作用

劉瑾春，李寧，鄭秀花，張瑞霞，楊曉紅

（1.河南護理職業學院 臨床醫學系診斷教研室，河南 安陽 455000；2.河南省中醫藥研究院附屬醫院康復醫學科，河南 鄭州 450003）

骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是軟骨組織工程中重要的種子細胞之一［1］。通過微粒體培養體系，目前在體外應用微粒體培養體系和含有轉化生長-β 的無血清培養液作為軟骨誘導液，已經能成功誘導BMSCs向軟骨分化［2］。但由于現行誘導方法仍不夠成熟，以BMSCs 為種子細胞的組織工程化軟骨組織構建距臨床應用尚有很大差距［3］。所以尋找一種高效、經濟的誘導方法，是實現以BMSCs 為種子細胞的軟骨組織工程走向臨床應用的關鍵。

甲狀腺激素是生長板中骨骼成熟的有效調節因子。生長板細胞對甲狀腺激素（T3）非常敏感［4］，在臨床上，甲狀腺毒癥和甲狀腺功能減退癥，分別代表甲狀腺激素的病理性增多和減少，對幼兒的生長發育具有重要的影響。在基礎研究中發現，甲狀腺素低下的小鼠會出現骨骺板內軟骨細胞增殖層和肥大層細胞減少，導致骺板厚度的降低［5］，而生理濃度的甲狀腺素能夠刺激胚胎軟骨組織的生長和體外成熟［6］。因此筆者通過本研究探討關于甲狀腺激素在體外BMSCs 成軟骨誘導方面的作用和對軟骨細胞肥大的影響。

1 材料和方法

1.1 豬BMSCs 的分離、培養和擴增

健康小型豬（日齡10～15 d）用常規方法抽骨髓5 mL，加入DMEM 培養液30 mL，混勻，1 500 rpm 離心10 min，棄上清，反復洗滌2 次。離心后加入10 mL 10%胎牛血清低糖DMEM 培養液，混勻；取少量細胞懸液，用4%乙酸1∶1 破壞紅細胞，常規計數；以DMEM 培養液稀釋至4×106個有核細胞/mL，于100 mm 培養皿內按6×105個有核細胞/cm2的細胞密度接種。置于37℃、5%CO2、100%飽和濕度的條件下培養，培養至4～5 d 換液，此后每2～3 d 換液1 次，常規傳代培養。棄培養液，PBS 洗滌1 次，加入2.0 mL 細胞消化液，常規在鏡下觀察，見大部分細胞離壁后，吸除消化液，中止消化，收集細胞至離心管，1 500 rpm 離心5 min，棄上清液，洗滌，離心。重復洗滌1 次，棄上清液，加入DMEM 培養液混勻，臺盼藍染色，計數，以1.5×104/cm2的密度接種，置于37℃、5%CO2、100% 飽和濕度的條件下培養，每2～3 d 換液1 次，達到融合狀態可繼續傳代培養，收集第3 代（P3）細胞，離心形成Pellets。

1.2 Pellet 培養及分組設計

P3 BMSCs 按上述方法獲得。將1 mL 小份細胞懸液（密度為5×105cells/mL）置于15 mL 聚丙烯管中，并以600×g 離心5 min 以形成Pellets 顆粒，然后將這些Pellets 顆粒分為兩組，在表1 所列的培養基中培養。

表1 軟骨誘導培養液成分與分組設計

1.3 MTT 生長曲線測定

MTT 曲線測定時，平面培養的骨髓間充質細胞被分為2 組，按照上述分組的培養基培養。MTT 的測定方法：第3 代骨髓間充質細胞（P3）接種于96 孔板（美國Corning 公司）內，每孔內細胞數為2 000。在1 至7 天的同一個時間點，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL，pH7.4，PBS 液溶解），培養4 h 棄去培養液，每孔加1 mL DMSO，在搖床上裂解10 min，于490 nm 波長處測定裂解液的光吸收值。以DMSO 溶液為空白對照。所有樣本讀取6 個平行樣本進行統計。

1.4 組織學檢測

取材，4%多聚甲醛中固定，時間為24 h，脫水，石蠟包埋，切片（5 μm），然后進行HE 染色和甲苯胺藍染色。

1.5 總RNA 的提取

取材剪碎，加入1 mL TRIzol 試劑，室溫靜置（5 min），加入4℃氯仿400 μL，劇烈振蕩，時間為10 s，室溫靜置（15 min）；4℃，12 000 rpm 離心15 min，取上清0.5 mL，加500 μL 冷異丙醇混勻，靜置（10 min），4℃，12 000 rpm 離心10 min；棄上清，加1 mL 75%乙醇［稀釋0.01%焦碳酸二乙酯（DEPC）］，振蕩；離心，4℃，7 500 rpm 離心10 min；棄上清；50 μL 0.01%DEPC 水溶解，混勻，測光密度（OD）值，調整RNA 濃度至1 μg/μL，瞬時離心，-80℃保存。

1.6 定量逆轉錄聚合酶鏈反應

定量PCR 分析采用生物Rad-CFX96TM-PCR機進行PCR 循環。表2 列出了豬甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）、Ⅰ型膠原（Col-Ⅰ）、Ⅱ型膠原（Col-Ⅱ）、Ⅹ型膠原（Col-Ⅹ）、性別決定基因9（SOX9）、聚集蛋白聚糖（aggrecan）、Runt 相關轉錄因子2（RUNX2）和基質金屬蛋白酶13（MMP13）的引物序列。反應曲線：94℃下預變性2 min；PCR 擴增40 個循環，94℃下15 s，60℃下30 s，隨后進行一系列循環，然后進行熔體曲線分析，以確保反應特異性。將各基因的表達水平用GAPDH 標準化。將對照組靶基因表達量設為1，用2（-△△CT）法顯示實驗組與對照組的基因表達。

表2 定量RT-PCR 引物序列

1.7 統計學方法

所有測量數據用SPSS 11.0 軟件進行分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 甲狀腺素促進了BMSCs 增殖

在兩種條件培養基中培養的BMSCs（P3）表現出不同的生長速率（圖1）。前4 d 兩組細胞生長速度差異無統計學意義（第1 天：t=0.000，P=1.000；第2 天：t=1.113，P=0.292；第3 天：t=0.924，P=0.377；第4 天：t=1.951，P=0.080）。從第5 天到第8 天，T3 組的生長速度明顯高于對照組，差異有統計學意義（第5 天：t=4.652，P=0.001；第6 天：t=4.277，P=0.002；第7 天：t=4.814，P=0.001；第8 天：t=5.636，P＜0.001）。

2.2 組織化學檢查

對照組軟骨細胞培養液誘導的BMSCs 顆粒形成了具有腔隙樣結構的軟骨樣組織，周圍區域甲苯胺藍染色陽性（圖2A、圖2C），表明各組細胞周圍基質中有大量軟骨GAG 基質積聚。T3 組的BMSCs 顆粒顯示更明顯的陷窩樣結構形成（圖2B），甲苯胺藍染色強于對照組，纖維和軟骨陷窩較多（圖2D）。

圖1 T3 組和對照組BMSCs 的MTT 法測定比較

圖2 兩組BMSCs 顆粒染色

2.3 BMSCs 顆粒在不同條件軟骨細胞誘導培養基中的實時定量PCR 表達

甲狀腺素實時定量PCR 顯示在不同的條件誘導液下BMSCs 的軟骨特異基因在體外培養4 周的表達情況（圖3）。甲狀腺素明顯的促進了SOX9，Col-Ⅱ和aggrecan 的表達，差異有統計學意義（SOX9：t=5.741，P=0.001；Col-Ⅱ：t=3.393，P=0.015；aggrecan：t=10.764，P=0.001），但是甲狀腺素也促進了軟骨細胞肥大相關基因Col-Ⅹ和MMP13 的表達，差異有統計學意義（P＜0.05）（Col-Ⅹ：t=14.632，P=0.001；MMP13：t=3.417，P=0.014），成骨方向的相關基因RUNX2 和Col-Ⅰ的表達未有明顯的增強，兩組比較差異無統計學意義（Col-Ⅰ：t=1.739，P=1.133；RUNX2：t=1.924，P=0.103）。

圖3 BMSCs 顆粒在不同條件軟骨細胞誘導培養基

3 討論

BMSCs 是軟骨組織工程中重要的種子細胞，調控BMSCs 高效向軟骨方向分化，分泌軟骨特異的細胞外基質，形成外觀、化學成分、機械功能與正常軟骨相似的組織是目前科研工作的重要課題。TGF-β 超家族是BMSCs 成軟骨誘導中最常用的生長因子，包括TGF-β、BMP 等［9］，但是這種誘導方法在以BMSCs 為種子細胞形成的組織工程軟骨在功能上尚達不到機體軟骨的程度［10］。探索更優化的軟骨誘導方案勢在必行。甲狀腺素是機體內調節生長板軟骨生長和骨骼成熟的重要系統內分泌因子，刺激生長板軟骨細胞的生長和成熟［11］。本研究在體外以BMSCs 為種子細胞的軟骨組織工程中應用甲狀腺激素，發現甲狀腺素可促進骨髓間充質干細胞的增殖和軟骨形成，同時也誘導的軟骨細胞肥大相關基因表達。

研究中應用甲狀腺素誘導BMSC 細胞向軟骨細胞分化的思路來自于臨床疾病學和實驗動物學的研究：臨床上幼兒甲狀腺素低下會導致骨軟骨發育不全和呆小癥狀；甲狀腺素低下的小鼠會出現骨骺板內軟骨細胞增殖層和肥大層細胞減少，導致骺板厚度的降低，補充甲狀腺素可以逆轉這種生長板的紊亂，而補充生長激素則不能逆轉這種紊亂，提示甲狀腺素有促進軟骨細胞增殖和成熟的作用。生理濃度甲狀腺素與核受體結合，進而調控軟骨細胞增值和軟骨相關基因的表達［12］。甲狀腺激素調控BMSC 軟骨發生的機制目前仍不清楚，研究發現用甲狀腺激素處理的生長板軟骨細胞上調了Wnt-4 mRNA 和蛋白的表達，增加了穩定的β-catenin 在細胞內的積累，增加了TCF/LEF 轉錄活性，并刺激了RUNX2/cbfa1 基因的表達［13］。另有研究顯示，聯合應用甲狀腺素、胰島素和骨形態發生蛋白2，結果獲得更多的軟骨細胞。因此推測甲狀腺素是通過與胰島素、骨形態發生蛋白2（BMP2）的信號通路相互作用而發揮誘導作用的，另外一個可能的重要蛋白是BMP6，在應用TGF-β 和地塞米松基礎上，聯合應用BMP-6可以顯著促進hBMSCs 成軟骨分化，可使hBMSCs聚集的重量增加10 倍，GAGs 染色更加致密［14］。

在軟骨組織工程中，應用BMSC 細胞為種子細胞，向軟骨細胞誘導過程中一個關鍵的問題是軟骨細胞的肥大。肥大的軟骨細胞的特征是細胞體積增加，細胞外基質鈣化，肥大的軟骨細胞發生凋亡。肥大型軟骨細胞被認為是終末分化的軟骨細胞，通過偶聯軟骨形成和骨形成過程而在骨骼發育中起到過渡的作用［15］。一般情況下認為肥大軟骨細胞不可避免的趨向于凋亡，因此軟骨組織工程中并希望避免肥大表型在細胞出現。本研究顯示，在甲狀腺激素誘導BMSC 軟骨發生的過程中，雖然軟骨特異基因的表達增強了，但是軟骨肥大相關基因Col-Ⅹ和MMP13 同時也被誘導增強了。已經知道，以軟骨細胞為種子細胞，生理濃度甲狀腺素素（0.1～1.0 nmol/L）能夠促進軟骨細胞肥大分化；但是高濃度的甲狀腺素（100 nmol/L）反而抑制了軟骨細胞的肥大分化：高于100 nmol/L 的T3 可以明顯地抑制軟骨細胞體外培養時的去分化和肥大分化，軟骨肥大相關基因（Col-Ⅹ，MMP13）的表達均低于常規培養組［16］。以BMSC 為種子細胞，誘導其軟骨發生的傳統的誘導液包含TGF-β 和地塞米松，這種誘導液可以引起軟骨細胞肥大；如果在軟骨誘導液中添加生理濃度（1 nmol/L）甲狀腺素，則可以進一步明顯的誘導軟骨細胞肥大，而這種誘導又是通過骨形態發生蛋白4 發揮作用的，BMP 拮抗劑Noggin 可阻斷甲狀腺素的BMSC 軟骨發生的軟骨肥大表型增強作用［17］。高濃度的甲狀腺素在誘導BMSC 軟骨發生的過程中是否能避免軟骨細胞肥大表型方面的研究較少。在本研究中，在BMSC 細胞軟骨誘導分化中應用高濃度甲狀腺素（100 nmol/L），結果顯示軟骨細胞肥大相關基因的表達增強。種子細胞的不同可能是造成高濃度甲狀腺素的作用不同的主要原因，具體機制仍不清楚。研究發現bFGF 和甲狀旁腺激素相關蛋白（PTHrP）可抑制TGF-β 引起的早期肥大分化［18］；混合共培養發現人軟骨細胞分泌的可溶性因子能抑制TGF-β 誘導后的BMSCs 早期肥大分化，其中軟骨細胞分泌的胰島素樣生長因子5，胰島素樣生長因子5 可能發揮重要的作用［19］。理想的誘導方案能夠同時促進軟骨特異基因和蛋白表達，同時不增加軟骨細胞肥大表型的表達，更優化的聯合誘導方案仍需進一步探索。

綜上所述，本研究在誘導骨髓間充質干細胞軟骨形成的過程，觀察和探索了軟骨誘導液中添加甲狀腺素對軟骨特異基因表達和軟骨肥大表型的影響，發現甲狀腺素可促進間充質干細胞的增殖和軟骨形成，同時也誘導了軟骨細胞肥大相關基因的表達增強，這些結果為研究軟骨組織工程的誘導方案提供了有益的線索。