基于網絡藥理學和分子對接探討防己黃芪湯治療腎性水腫的機制與通路*

袁鑫，張林，歐祥琴，王喜紅，唐閣，梁峰

（1．張家界市中醫醫院，張家界 427000；2．天津中醫藥大學，天津 301617；3．貴州中醫藥大學第一附屬醫院，貴陽 550001；4．天津中醫藥大學第一附屬醫院，天津 300193；5．香港浸會大學中醫藥研究學院，香港 999077）

水腫是腎臟疾病最常見的臨床表現之一[1]，多發于眼瞼或顏面，進而蔓延至下肢，甚至全身，常伴有蛋白尿、血尿、高血壓等其他臨床癥狀[2]，其發病機制主要與腎小球濾過率改變有關，腎小球毛細血管內皮細胞過度增生，腎小球濾過率驟降，“球-管失衡”以致水鈉潴留，發為水腫[3]。西醫對腎性水腫的治療多為對癥處理，利尿劑雖顯效較快，但易復發，且長期應用激素會導致激素依賴甚至激素抵抗，不利于患者遠期康復。既往研究表明，防己黃芪湯對多種原因所致的腎性水腫效果顯著[4-8]，并可逐漸降低激素使用量，減輕不良反應，但其具體機制仍未明確[9]。

中醫本無腎性水腫之名，根據臨床表現，可將其歸屬于“水腫”“血尿”“尿濁”等范疇，其病機不外乎本虛標實，虛實相兼，肺脾腎3臟虛為本；風寒濕熱、濁毒侵犯、瘀血內生為標。治療大法多以溫補脾腎、溫陽化氣為主[2]。防己黃芪湯是《金匱要略》治療風水的代表方，具有補氣健脾、除濕祛風、利水消腫之功。其中防己、黃芪兩者配伍，祛風利濕不傷表，固表止汗不留邪，白術健脾利濕，甘草調和藥性，諸藥相合，相得益彰。目前，防己黃芪湯治療腎性水腫臨床療效已獲肯定，各單味藥化學成分亦有報道，但中藥成分復雜，其相關機制研究仍不夠全面。

網絡藥理學雖已廣泛應用于藥物靶點的預測，但尚缺乏實驗或數據的支撐，說服力仍有待增強，故本研究在網絡藥理學基礎上聯合分子對接技術對其進行驗證，通過分子對接的結合情況來探究靶點之間的親和力，驗證防己黃芪湯治療腎性水腫相關通路的可行性，彌補網絡藥理學的不足，探求防己黃芪湯治療腎性水腫的潛在分子機制，為臨床疾病的治療和相關實驗提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料 中藥系統藥理學數據庫（TCMSP）（http：//lsp．nwu．edu．cn/tcmsp．php）篩選防己黃芪湯藥物成分靶點；UniProt數據庫（https：//www．uniprot．org/）篩選靶點蛋白對應的基因；OMIM數據庫（https：//www．omim．org/）和 gene card 數據庫（https：//genecards．weizmann．ac．il/v3/）檢索腎性水腫相關的基因；String數據庫（https：//string-db．org/cgi/input．pl）和 Cytoscape 3．7．1 軟件作蛋白互作網絡圖；基于 R Stuidio1．2．5042版本的R 4．0．0語言做基因本體論（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析；利用PDB數據庫（https：//www．rcsb．org/）搜索主要蛋白的結構式；采用PyMOL 2．4．0進行切除蛋白配體和分子對接演示；運用 AutodockTools 1．5．6 做網格盒子（Grid Box）；應用Autodock Vina做分子對接。

1.2 方法

1.2.1 藥物成分篩選 采用TCMSP中藥系統藥理學技術平臺檢索防己黃芪湯化學成分，以藥物成分的口服利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0．18為標準進行篩選，建立符合標準的成分數據列表。

1.2.2 腎性水腫相關靶標檢測 采用genecard和OMIM數據庫檢索關鍵詞為“Nephritis Edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”的疾病基因信息，對目前公認的與腎性水腫（包括原發與繼發）相關的疾病靶基因進行篩選，建立excel數據列表；通過Microsoft excel 2013軟件的分列功能、Vlookup函數、Trim函數、宏程序等相關插件批量獲取UniProt數據庫的對應基因，并對靶點基因名稱進行校正。

1.2.3 構建方劑成分-靶標-疾病網絡示意圖 通過R 4．0．0中的VennDiagram程輯包，對兩份數據集取交集，得到防己黃芪湯與腎性水腫相關的潛在共同作用靶標，并通過Cytoscape 3．7．1軟件進行多元素間的數據可視化處理。

1.2.4 通路富集分析 通過R4．0．0中的clusterProfile、pathview、org．Hs．eg．db 等相關生物包，進行防己黃芪湯與腎性水腫靶點的GO和KEGG富集分析。

1.2.5 分子對接驗證 1）利用Cytoscape 3．7．1篩選出“藥物-疾病”靶點蛋白度值（Degree）排名前5位的藥物成分。2）應用TCMSP數據庫下載相關成分的結構。3）根據配體同一性，應用PDB數據庫下載對應蛋白。4）利用 PyMOL2．4．0 對蛋白去水、摘除配體。5）運用 Auto Docks Tools 1．5．6 根據配體曾經所在位置尋找Grid Box。6）使用Autock Vina進行分子對接，以結合能值評價受體與配體的結合情況。

2 結果

2.1 藥物成分篩選結果 通過TCMSP數據庫檢索防己黃芪湯，設置OB≥30%且DL≥0．18，共檢索到有效成分122個，其中防己3個，黃芪20個，甘草92個，白術7個，其中白術和黃芪共有成分1個，甘草和黃芪共有成分7個。防己黃芪湯部分活性化合物基本信息見表1。

表1 防己黃芪湯部分有效活性物質Tab.1 Part of effective active substances in Fangji Huangqi decoction

2.2 方劑-成分-靶標排名 根據2．1所搜索的藥物成分，使用UniProt數據庫，查詢相關靶點基因的信息，共獲得藥物靶基因229個，并導入Cytoscape 3．7．1制作網絡圖，根據degree值篩選排名前5位的成分，見表2。

表2 根據Degree排名前5的成分和靶點Tab.2 Top five components and targets according to degree

2.3 腎性水腫靶標成分篩選 根據“Nephritis edema，Primary nephritic edema，Secondary nephritic edema”這3個關鍵詞，使用OMIM、genecard數據庫，共搜索到187個與腎性水腫相關的靶基因，與2．2所得的藥物靶標取交集，共得到39個相交基因，交集基因信息見表3。

表3 藥物-疾病靶基因交集Tab.3 Intersection of drug-disease gene

2.4 PPI網絡圖構建 將2．3所獲取的藥物與疾病靶標交集導入String網，物種選擇Homo sapiens，將隨機交互可信度設置為0．4，最低評分為0．4時為中等可信度，0．7表示高可信度，0．9表示最高可信度。本研究選用中等可信度的PPI網絡，下載對應的TSV格式網絡圖，將R4．0．0的靶點作條形圖，見圖1；Cytoscape 3．7．1 作 PPI網絡圖，見圖2。

圖1 蛋白互作條形圖Fig.1 Barplot of protein interaction

圖2 蛋白互作網絡圖Fig.2 Network of protein interaction

條形圖顯示了蛋白互作度，由圖可知，較為重要的蛋白分別是白介素（IL）-6（34）、腫瘤壞死因子（TNF）（34）、血管內皮生長因子（VEGFA）（33）、腺苷酸激酶同工酶（ATK1）（31）、IL-10（31）等。網絡圖中，蛋白互作度越大，所對應的顏色越深。

2.5 GO功能和KEGG富集分析

2.5.1 GO 功能富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包對防己黃芪湯的預測靶點進行 GO 功能富集分析，pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，提取核心交互靶點20個，蛋白的作用機制主要與細胞因子活性、細胞因子結合受體、受體配體活動、生長因子活性等因素有關。見圖3。

圖3 GO富集分析Fig.3 GO terms enrichment

2.5.2 KEGG 富集分析 利用 R4．0．0 中的 org．Hs．eg．db和clusterProfiler包對防己黃芪湯的預測靶點進行KEGG通路富集分析，設定pvalue Cutoff=0．05，qvalue Cutoff=0．05，共得到 108 條通路，提取核心通路20個，見圖4。防己黃芪湯治療腎性水腫的主要通路有晚期糖基化終產物與晚期糖基化終產物受體（AGE-RAGE）通路、瘧疾通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、TNF通路、低氧誘導因子信號通路等。AGE-RAGE通路富集情況。見圖5。

圖4 KEGG通路富集分析Fig.4 KEGG pathway enrichment

圖5 AGE-RAGE通路富集情況Fig.5 AGE-RAGE signal pathway

2.6 分子對接驗證 根據蛋白互作圖中排名前5位的蛋白（IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10），在 PDB數據庫中進行檢索，共檢索出IL-6 23個，TNF 599個，VEGFA 41個，ATK1 0個，IL-10 15個。以配體作為篩選項，根據排名前5藥物成分（槲皮苷、山奈酚、芒柄花黃素、異鼠李素、7-甲氧基-2-甲基異黃酮）的分子結構選擇對應的蛋白，經化學結構篩選，發現TNF-α抑制劑3EWJ和3E8R的配體結構與藥物成分結構類似，故對其進行分子對接驗證。

經 PyMOL 2．4．0去除水分子后切除 3EWJ的配體642，切除3E8R的配體615，保存為pdb格式，使用 AutodockTools 1．5．6 把文件格式統一轉換成pdbqd，并根據原配體所在位置設置網格盒子相關參數，根據參數使用Autodock Vina做分子對接。

一般認為分子對接時，結合能值越低，對接構象越穩定，發生作用的可能性越大，結合能小于0說明配體和受體可自發結合[10]。對接結果見表4，根據分子結合能打分比較，可見山奈酚與3EWJ和3E8R的對接結合能最低，山奈酚與3EWJ和3E8R對接時，結構穩定。

表4 防己黃芪湯核心成分與3EWJ和3E8R的分子對接結果Tab.4 Molecular docking results of Fangji Huangqi decoction with 3EWJ and 3E8R

3 結論

防己黃芪湯可能通過槲皮素、山奈酚、異鼠李素等化學成分作用于 IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10等因子，進而調控AGE-RAGE和TNF信號通路以發揮治療腎性水腫的藥效作用。

4 討論

本研究通過TCMSP數據庫獲得防己黃芪湯的化學成分共122種，基于該活性成分的預測靶點共229個，腎性水腫的靶基因共189個，其中疾病基因與藥物基因配對且符合評分0．4的PPI網絡靶點共39個，選擇度值最大的5個靶點做分子對接驗證。

所得出的5個最大度值靶點中（IL-6，TNF，VEGFA，ATK1，IL-10），IL-6 和 TNF-α 在防己黃芪湯的治療中研究較為廣泛。在人體研究中，杜衛軍等學者[11]認為防己黃芪湯能通過IL-6、TNF-α改善腎病綜合征患者的炎性反應；李玉卿等[12]的隨機對照研究發現防己黃芪湯能明顯降低IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平，改善慢性腎炎患者的微炎癥狀態。在動物研究中，俞東容等[13]認為防己黃芪湯能調節單側輸尿管梗阻大鼠腎組織中TGF-β、BMP-7的表達，減輕腎臟損害；范穎等[14]通過阿霉素誘導腎病大鼠模型，發現防己黃芪湯能有效抑制大鼠腎組織轉化生長因子-β1（TGF－β1）、白細胞介素-18（IL-18）的表達，改善炎癥反應，進而抑制腎小管轉分化、腎小管萎縮；李武等[15]在慢性腎衰大鼠模型中發現防己黃芪湯可下調VEGFA的表達，且VEGFA和AKT與腎臟纖維化存在一定的相關性[16]，這可能與PI3K/AKT/VEGFA通路有關[17]。上述研究表明，防己黃芪湯可通過調節 IL-6、TNF、VEGFA、ATK1、IL-10來發揮治療腎性水腫的藥效作用，且這些因子與AGERAGE和TNF信號通路有關。

在52個GO富集分析中，多為細胞凋亡和增殖、炎性反應、應激反應等。細胞因子活性、生長因子活性可能是防己黃芪湯治療腎性水腫的關鍵生物學過程。研究發現，糖尿病腎病患者外周血單核細胞組織因子促凝活性明顯升高，這可能與糖尿病腎病的發病機制、病程進展相關[18]。

在108個KEGG通路中，AGE-RAGE信號通路、瘧疾信號通路、TNF信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、低氧誘導因子信號通路的度值排名最為靠前。AGE-RAGE通路可通過改變蛋白質的生理功能、觸發細胞級聯反應，導致濾過屏障解體、引發氧化應激和腎臟纖維化，加快慢性腎臟病的進展[19]。腎小球AGE的積累可使單核細胞趨化蛋白1（MCP－1）高表達，促進巨噬細胞聚集，導致細胞外基質積累及腎纖維化。糖尿病腎病發展的重要機制包括AGE-RAGE信號通路，此機制可激活核轉錄因子-κB（NF－κB），促進 VEGF 和 TGF－β1的產生，最終會引起氧化應激，加速腎功能惡化[20]。在糖尿病腎病的研究中，一項生物信息學研究[21]指出，防己黃芪湯治療2型糖尿病與AGE-RAGE信號通路有關；黃芪對腎小球系膜細胞具有一定的保護作用，黃芪桂枝五物湯可通過阻斷AGEs/RAGE/NF-κB信號通路中組織細胞表面RAGE的表達、抑制NF-κB激活及其引發TNF-α觸發的氧化應激和炎癥反應，從而減輕糖尿病大鼠神經病變[22]。而如圖4所示，TGF-β1、TNF-α、VEGF 均是AGE-RAGE 的重要組成，故防己黃芪湯治療糖尿病腎性水腫的機制可能與AGE-GARE通路有關。對其余3條通路進行分析，瘧疾通路與腎損傷關系密切，瘧疾可通過減少血容量[23]，促進血管收縮、溶血、腎小球免疫復合物沉積、微循環功能障礙和橫紋肌溶解[24]而致腎損傷；流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路可以激活 NF-κB、MAPK，促進腎臟炎癥發生[25]；低氧誘導因子信號通路可誘導腎小管炎癥反應和腎間質纖維化形成[26]。通過分子對接技術驗證網絡藥理學結果，在分子對接模型中，TNF-α抑制劑3EWJ和3E8R的配體結構與藥物成分結構類似，分子對接模型顯示對接結果良好，配體與受體能主動結合，提示3EWJ和3E8R可能是山奈酚與TNF作用的靶蛋白，TNF是AGE-RAGE和TNF通路的重要組成部分，分子對接結果支持AGE-RAGE與TNF通路。

以上實驗均為本研究所得出的相關通路提供了一定的實驗依據，5條信號通路均可能是防己黃芪湯治療腎性水腫的關鍵通路，但結合既往研究與分子對接驗證結果，筆者認為腎性水腫的通路更可能與AGE-GARE和TNF信號通路有關，這兩條通路研究較為廣泛。既往研究發現加味防己黃芪湯能夠通過調控TNF-α、IL-10進而減輕腎臟的炎性反應，降低原發性腎病綜合征患者IL-1β、IL-6、IL-10[27]及TNF-α的表達水平，上述相關因子在兩條通路中均有表達，故防己黃芪湯很可能通過調控AGE-RAGE和TNF信號通路而改善腎性水腫。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學方法和分子對接技術，初步探討了防己黃芪湯治療腎性水腫的潛在作用機制。文章雖通過TCMSP得到防己黃芪湯的有效化學成分，但中藥成分之間相互作用復雜，且復方制劑影響因素較多，后期可通過UPLC、UPLC-Q-TOF-MS等方法對防己黃芪湯成分進行檢測，本課題組將在后續研究中設計相關實驗以進行驗證。