墨旱蓮提取物促進小鼠骨髓來源的間充質干細胞遷移和成骨方向分化作用研究*

安然，蔡銘祺，覃小燕，韋秋，楊云，毛浩萍

（天津中醫藥大學方劑與教育部重點實驗室，天津 301617）

骨質疏松癥（OP）是一種常見的代謝性骨骼疾病，其特點是骨小梁結構消失、骨量降低，骨折的風險升高[1]。骨質疏松患者主要是老年人和絕經期后女性，OP基本發病機制是骨代謝失衡，破骨細胞介導的骨吸收大于成骨細胞負責的骨形成[2]。目前對于OP的治療應主要是通過刺激骨形成或抑制骨吸收。臨床用藥主要有雙膦酸鹽、地諾單抗和羅莫珠單抗。他們多數是通過調節破骨細胞增生、分化及凋亡從而減少骨吸收。研究表明，雙膦酸鹽藥物和地諾單抗只能抑制骨吸收，不具備增加骨形成的能力[3-4]。羅莫珠單抗是作用于骨硬化蛋白的單克隆抗體，是唯一具有雙重作用的抗骨質疏松藥物，它既可以抑制骨吸收又可以通過調控成骨細胞分化和增殖作用促進骨形成[5]。然而羅莫珠單抗產生嚴重心血管事件問題尚未解決，尋找新的治療藥物是迫切需要的，具有重要意義[6]。

小鼠骨髓來源的間充質干細胞（BMMSCs）具有增殖能力和向多種細胞分化潛能[7]。在OP導致的骨損傷發生后，BMMSCs及其周圍的骨膜、軟組織間充質等前體細胞增生，遷移到受損部位，分化為成骨細胞、成軟骨細胞，從而促進骨組織恢復[8]。因此，調控BMMSCs遷移和分化平衡，促進BMMSCs趨于向成骨細胞分化，有助于骨形成，對治療OP具有重要意義。

墨旱蓮為菊科植物鱧腸Eclipta prostrate L．的干燥地上部分，化學成分主要分為三萜類、黃酮類、噻吩類、香豆素類、甾體類[9]。墨旱蓮主治肝腎不足，眩暈耳鳴，視物昏花，腰膝酸軟等癥狀[10]。多項研究表明，墨旱蓮提取物（EHE）可改善多種骨質疏松模型小鼠的骨微結構損傷，且具有抑制破骨細胞骨吸收活性的作用[11-13]。其中，墨旱蓮有效成分蟛蜞菊內酯通過Wnt/GSK3β/β-連環蛋白信號通路促進成骨細胞生成[14]，而墨旱蓮是否促進BMMSCs的遷移和分化作用未見報道，需要進一步闡明。本研究通過探究EHE對BMMSCs的遷移和分化的作用及可能的作用機制，為后續墨旱蓮治療OP的作用機制提供研究方向。

1 材料

1.1 動物 SPF級6周雌性C57BL/6J小鼠，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2014-0004。動物飼養于天津中醫藥大學動物房。

1.2 藥品與主要試劑 墨旱蓮藥材購自安國祁安藥業有限公司；基礎培養基（αMEM）、胎牛血清、聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）檢測試劑盒、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（賽默飛世爾科技，美國）；青霉素-鏈霉素混合液（10 000 U/mL青霉素G鈉鹽，10 mg/mL硫酸鏈霉素）、成骨誘導劑、成脂誘導劑、油紅O檢測試劑盒（BI，以色列）；5-溴-4-氯-3- 吲哚基-磷酸鹽/氯化硝基四氮唑蘭（BCIP/NBT）顯色試劑盒、蛋白裂解液（RIPA）（上海碧云天生物技術有限公司，中國）；茜素紅粉末、甲苯胺藍粉末（北京索萊寶科技有限公司，中國）；基質細胞衍生因子-1（SDF-1）（R&D Systems，美國）；兔抗鼠 β-肌動蛋白（βactin）一抗、兔抗鼠CXC趨化因子受體4（CXCR4）一抗、山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（賽信通生物試劑有限公司，美國）；增強型化學發光液（ECL發光液）（默克，美國）

1.3 儀器 二氧化碳（CO2）恒溫培養箱（賽默飛世爾科技，美國）；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司，中國）；細胞遷移侵襲（Transwell）小室（美天旎生物技術公司，德國）；倒置顯微鏡（尼康，日本）；臺式高速離心機（貝克曼庫爾特有限公司，美國）；-40℃低溫冰箱（三洋，日本）；電泳槽、半干轉（伯樂，美國）。

2 方法

2.1 EHE的制備 2 kg墨旱蓮藥材用70%乙醇回流2次，每次2 h。將提取物濃縮至200 g，4℃條件下儲存。憑證標本（編號20161229）保存在天津市中藥化學與分析重點實驗室。采用多反應監測（MRM）的超高效液相色譜-串聯四級桿質譜（UPLC-MS/MS）法測定了 7 種主要化合物的濃度，0．233±0．005 mg/g（旱蓮苷 IV），1．021±0．004 mg/g（旱蓮苷 A），0．272±0．003mg/g（芹菜素），0．115±0．00mg/g（3’-羥基生物素A），0．306±0．004 mg/g（木犀草素），0．125±0．008 mg/g（木犀草素-7-O-葡糖苷），0．271±0．001 mg/g（蟛蜞菊內酯）[15]。

2.2 小鼠原代BMMSCs的提取與培養 在無菌條件下，取小鼠雙側股骨和脛骨，置于含10%雙抗的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，剔除肌肉組織，使用用含有10%血清和1%雙抗的α-MEM的培基沖洗骨髓腔至無菌細胞培養皿中，收集細胞懸液。經70 μm細胞篩過濾，過濾后培養于25 cm2的培養瓶中，每2～3 d換液，待細胞融合度達到90%后可進行傳代，傳至第3代后用于后續實驗。

2.3 小鼠原代BMMSCs表面抗原鑒定 BMMSCs使用胰酶消化后，加入預冷PBS，調整細胞密度為3×107個細胞/mL。采用流式細胞儀鑒定，分別加入不同的熒光標記的單克隆抗體渦旋混勻，在冰上避光孵育30 min，采用流式細胞儀鑒定。

2.4 小鼠原代BMMSCs誘導分化鑒定 第3代BMMSCs接種于96孔板，細胞密度為6×104個細胞/mL，加入成骨細胞誘導劑，培養72 h后棄細胞培養液，用PBS潤洗細胞2次，進行堿性磷酸酶（ALP）染色；培養2周后進行茜素紅染色；加入軟骨細胞誘導劑培養2周后進行甲苯胺藍染色；加入脂肪細胞誘導劑，培養10 d后進行油紅O染色。

2.5 細胞遷移侵襲（Transwell）檢測第3代BMMSCs鋪板于8 μm孔徑的Transwell小室上層，小室下層加入 50 ng/mL SDF-1、0．1 μg/mL 和 1μg/mL EHE，6 h后用棉簽擦去小室上層還未穿過薄膜的細胞，進行結晶紫染色，顯微鏡下觀察并拍照遷移后的細胞。

2.6 蛋白質印跡法（Western Blot）方法檢測CXCR4蛋白表達 加入細胞蛋白裂解液，冰上裂解15 min。12 000 r/min，離心半徑10 cm，4℃離心 15 min，離心后取上清，使用BCA蛋白質分析試劑盒測定上清液中的蛋白質濃度。將各組蛋白濃度調整至1．5mg/mL。加入5×蛋白上樣緩沖液，金屬浴100℃加熱5 min，制備樣品結束。樣品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），然后將蛋白轉移到用濾紙包裹PVDF膜中。三乙醇胺-吐溫緩沖（TBST）配置的5%牛奶中進行封閉2 h。PVDF膜在4℃下在TBST制備的一抗體稀釋液中孵育過夜。第2天回收一抗，用TBST洗膜3次。加入二抗室溫孵育2h。用TBST洗膜3次。最后使用化學發光試劑ECL顯影，用Image j軟件測定蛋白質條帶的灰度值。

2.7 ALP活性檢測 第3代BMMSCs接種于96孔板，細胞密度為6×104個細胞/mL，設置對照組和成骨誘導劑組。成骨誘導劑組給予EHE，劑量分別為0．1和1 μg/mL。72 h后進行ALP活性檢測。

2.8 統計學方法 使用SPSS 26．0統計軟件，計量資料用均數±標準差（±s）表示，多組間均數比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），多重比較采用Dunnett檢驗。P＜0．05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 小鼠原代BMMSCs培養和鑒定 分離提取得到的BMMSCs正常培養狀態下，鏡下觀察如圖1所示。培養3 d后的小鼠BMMSCs呈圓形；培養7 d后貼壁細胞呈長梭形。采用流式細胞儀檢測結果顯示，培養的細胞表面分子sca-1的表達率為86%、分化簇（CD）29的表達率為99%、CD140α的表達率為88．7%、CD90 的表達率為 63．7%以及 CD45 的表達率為14%、CD34的表達率為1%。

圖1 小鼠原代BMMSCs培養與鑒定Fig.1 Culture and identification of mouse primary BMMSCs

BMMSCs經成骨細胞誘導劑誘導后，ALP染色觀察發現被黑染的成骨細胞，茜素紅染色觀察發現紅色礦化結節樣的成骨細胞；經軟骨誘導后，甲苯胺藍染色觀察發現被藍染的軟骨細胞；經成脂誘導后，油紅O染色觀察發現橘紅色脂滴樣的脂肪細胞。以上結果表明提取得到的細胞符合BMMSCs的特性。

3.2 墨旱蓮提取物對小鼠BMMSCs遷移能力的影響 結果表明，與對照組相比，0．1和1 μg/mL EHE能顯著提高BMMSCs的遷移能力，差異具有統計學意義（P＜0．05）。見圖2。

圖2 Transwell實驗探究EHE對小鼠BMMSCs遷移能力的影響Fig.2 Transwell experiment to explore the effect of Eclipta chinensis extract on the migration ability of mouse BMMSCs

3.3 墨旱蓮提取物對小鼠BMMSCs中CXCR4蛋白表達的影響 Western Blot實驗結果顯示，與對照組相比，1 μg/mL EHE具有提高CXCR4蛋白表達的趨勢，0．1 μg/mL EHE 顯著提高 CXCR4 蛋白的表達（P＜0．05），差異具有統計學意義。見圖3。

圖3 Western Blot檢測EHE對小鼠BMMSCs中CXCR4蛋白表達的影響Fig.3 Western blot detection of eclipta extract on the expression of CXCR4 protein in mouse BMMSCs

3.4 墨旱蓮提取物對小鼠BMMSCs向成骨細胞分化作用 ALP是BMMSCs向成骨細胞分化的標志性指標之一，ALP活性檢測結果顯示，與對照組相比，給予成骨誘導劑顯著升高 ALP 濃度（P＜0．05）；與給予成骨誘導劑相比，1 μg/mL EHE具有升高ALP 濃度的作用，差異具有統計學意義（P＜0．05）。

ALP染色觀察發現，與給予成骨誘導劑相比，0．1和1 μg/mL EHE組細胞形態由長梭型變為圓形，細胞體積變大，被黑染的成骨細胞數量增多；茜素紅染色觀察發現，與給予成骨誘導劑相比，0．1和1 μg/mL EHE組細胞形態由長梭型變為圓形，細胞體積變大，紅色礦化結節樣的成骨細胞數量增多。見圖4。

圖4 EHE對小鼠BMMSCs向成骨細胞分化作用Fig.4 The effect of eclipta extract on the differentiation of mouse BMMSCs into osteoblasts

4 討論

OP是一種系統性、多因素的骨病。由于骨微結構消失，骨密度降低，骨質疏松性骨折成為OP最常見的臨床癥狀，從而使患者面臨慢性疼痛和經濟負擔[16]。BMMSCs被認為是發育成骨細胞的主要來源，BMMSCs的功能對骨形成和骨微環境具有重要意義[17]。在OP患者中，BMMSCs可能會失去自我更新能力，且容易分化為脂肪細胞而不是骨細胞，從而導致骨丟失和脂肪堆積[18]。促進BMMSCs的向成骨細胞分化是恢復不平衡骨代謝的潛在策略。國際細胞治療學會[19]提出BMMSCs具有以下特點：1）在正常培養條件下貼壁生長。2）細胞表面標志物的表達。3）缺乏造血標志物的表達。4）具有多向分化的能力。本實驗提取分離獲得的BMMSCs，培養7 d后貼壁生長，呈長梭形。流式細胞儀檢測發現細胞表面標志物陽性表達的有 sca-1、CD29、CD140α、CD90，陰性表達的有CD45和CD34，符合BMMSCs表型。實驗可成功誘導BMMSCs分化為成骨細胞，軟骨細胞和脂肪細胞。以上結果表明提取的細胞符合BMMSCs特性。

BMMSCs可以通過較強的遷移和歸巢能力，到達受損組織部位，抑制炎癥并進行多向分化使受損組織進行傷口修復[20]。所以BMMSCs向骨表面遷移對骨形成和骨折愈合至關重要。CXCR4是SDF-1的G蛋白耦連特異性受體，可在細胞表面和胞漿中檢測到[21]。SDF-1/CXCR4信號通路參與各種細胞過程，常見于調控細胞遷移[22]，CXCR4蛋白在促進BMMSCs的遷移能力可能發揮著重要的作用[23]。研究發現，通過生物發光成像技術確定了BMMSCs在骨折部位的遷移是依賴時間和CXCR4表達量的，SDF-1與BMMSCs表面的CXCR4蛋白受體結合，促進BMMSCs的遷移能力[24-25]。所以促進CXCR4的表達可以提高BMMSC遷移能力、加快組織修復效率[26]。目前，提高BMMSCs遷移和分化能力的有多種方法，包括支架、水凝膠構建、基因修飾和改變細胞膜表面受體，但這些方法具有潛在的誘變和致癌風險，需要更多的研究來解決安全性問題[27]。

近年來，BMMSCs已成為OP治療研究的主要焦點。中醫對OP患者進行補腎治療?！鹅`樞》有云：“人始生，先成精，精成而腦髓生。”“腎藏精，主骨生髓”，故此從來源、分布、功能等方面發現“腎精”與現代醫學的干細胞形似[28-29]。因此推測BMMSCs向成骨分化的調節可能是OP治療中使用的補腎治療的部分科學依據。進而思考補腎類中藥是否可對BMMSCs的功能發揮促進作用。大量實驗研究表明，補腎類中藥及補腎活血復方可以促進BMMSCs增殖、定向遷移，尤其是對成骨分化作用明顯[30]。本課題組前期研究發現，滋陰補腎中藥墨旱蓮有效改善骨質疏松模型小鼠骨密度低，骨微結構破壞的情況。研究報道，墨旱蓮的乙酸乙酯提取物及其成分蟛蜞菊內酯具有促進BMMSCs增殖的作用[31]，且蟛蜞菊內酯可以促進BMMSCs向成骨細胞分化[32]。為“腎”與骨代謝的中醫理論提供了科學依據。因此，推測EHE可能通過調控BMMSCs的增值，遷移和分化從而發揮治療OP的作用。本研究結果顯示，EHE能促進BMMSCs的遷移和向成骨細胞分化，顯著提高CXCR4蛋白表達。

綜上，EHE具有促進BMMSCs遷移和向成骨分化作用，其調控BMMSCs遷移的作用機制可能與促進CXCR4蛋白表達相關。本課題組后續將研究EHE對誘導BMMSCs向成骨細胞分化的作用機制，為后續墨旱蓮治療骨質疏松的作用機制提供研究思路。