circRNA作用于急性缺血性腦卒中的研究進展

鄭繼青，龍耀斌△，劉云

急性缺血性腦卒中（AIS）由顱內動脈閉塞或顱外頸動脈閉塞引起，約占腦卒中的85%［1］，可導致腦組織死亡、局灶性神經缺陷，給患者和社會帶來巨大負擔。目前，靜脈溶栓和血管內治療是臨床上AIS常用的治療方法，但存在治療時間窗的限制以及神經細胞缺血再灌注損傷問題［2］。AIS最常用的診斷工具是CT和MRI，但MRI檢查不適用于安裝金屬支架的患者，且價格昂貴［3］，CT對大腦早期缺血變化并不敏感［1］。因此需探索靈敏、可靠、實惠的早期篩查和診斷的生物標志物及有效治療靶點。環狀RNA（circRNA）是一類特殊的非編碼RNA，以閉合環狀結構命名，其環狀二級結構由單鏈線性轉錄產物以反轉錄和共價鍵形成，在中樞神經系統中表達［4-5］。研究發現，circRNA能夠作為微小RNA（miRNA）的內源性競爭RNA（ceRNA），與mRNA競爭性地結合miRNA的位點，通過促進或抑制mRNA的表達，調控AIS的生理功能［6］。實時熒光定量PCR和高通量測序發現circRNA有作為AIS生物標志物的潛力［7-8］。本文現圍繞上述內容綜述如下。

1 circRNA作為ceRNA調控AIS的生理和病理過程

Salmena等［9］提出ceRNA調控基因表達的假說，認為通過miRNA反應元件，ceRNA能形成一種大規模轉錄調控網絡。circRNA作為一種ceRNA，在調控AIS的細胞凋亡、細胞自噬、血腦屏障及神經保護等生理病理過程中發揮關鍵作用。

1.1 circRNA作用于AIS的神經細胞凋亡AIS的發生發展與神經細胞凋亡失調有關，神經細胞凋亡是造成神經系統損傷的重要機制，在腦缺血早期，缺血中心區的細胞死亡以壞死為主，而缺血半暗帶細胞仍有代謝活力，可以持續數個小時，其后續死亡則以神經細胞凋亡為主［10-11］。因此抑制神經細胞凋亡對減少AIS的梗死面積和改善其預后十分重要。

Liu等［12］發現circ_0007865作為miR-214-3p的ceRNA可調控FK506結合蛋白5（FKBP5）的表達，沉默circ_0007865可以通過調控miR-214-3p/FKBP5軸，促進氧糖剝奪（OGD）處理的腦微血管內皮細胞的增殖、遷移、血管生成和抑制細胞凋亡，可能為AIS的治療靶點。有研究發現敲低circ-Memo1可調控miR-17-5p/非七激酶子同源物1（SOS1）信號通路，降低氧化應激和炎癥反應，抑制腦微血管內皮細胞凋亡，減輕腦缺氧再復氧的腦微血管內皮細胞損傷［13］。生長分化因子11（GDF11）是轉化生長因子-β（TGF-β）超家族成員，通過結合TGF-β的Ⅰ和Ⅱ受體來激活重組人SMAD家族成員3（Smad3）信號通路，進一步過表達Smad3蛋白來抑制腦缺血誘導的炎癥反應，對神經元凋亡具有保護作用［14］。Chen等［15］發 現circUCK2作 為 內 源 性miR-125b-5p的ceRNA，過表達circUCK2可調控miR-125b-5p/GDF11途徑，激活下游的TGF-β/Smad3信號通路，可提高小鼠海馬神經元存活率，改善OGD誘導的神經元損傷。HECT結構域E3泛素蛋白連接酶1（HECTD1）在腦微血管內皮細胞［16］和小鼠海馬神經細胞［17］的凋亡中發揮著重要作用。Chen等［18］發現circDLGAP4可通過充當miR-143的ceRNA來激活HECTD1的表達，過表達circDLGAP4會提高HECTD1的活性，從而調節腦缺血后腦血管內皮細胞的凋亡和細胞遷移，對腦缺血/再灌注損傷的修復起關鍵作用。此外，研究還發現外泌體circSHOC2作為miR-7670-3p的ceRNA，增強circSHOC2可提高去乙酰化酶1（SIRT1）的表達來調節神經元凋亡，推測circSHOC2/miR-7670-3p/SIRT1軸可能是AIS潛在治療靶點［19］。

1.2 circRNA作用于AIS的血腦屏障（BBB）BBB是大腦和外周循環之間的重要屏障，能嚴格調節血液和大腦間的營養交換和信息轉導，以維持對神經元回路、突觸傳遞和神經發生精確控制的微環境［20］。AIS損傷后，BBB會被破壞，導致繼發性腦水腫、毛細血管收縮和血流阻塞［21］，更為嚴重的是限制組織型纖溶酶原激活劑溶栓治療［22］，造成AIS預后不良，因此保護BBB是治療AIS的重要策略。

有研究者通過對腦缺血小鼠circRNA的高通量測序數據進行生物信息學分析發現，血小板源性生長因子（PDGF）和趨化因子通路等對非破壞性腦缺血刺激有重要作用［23］。抑制PDGF通路的PDGF受體α和PDGF-CC的表達可降低腦血管通透性以及限制炎性細胞進入大腦［24-25］，表明circRNA可能通過調控PDGF通路調節腦缺血的血管生成、免疫反應和神經血管保護來影響BBB的完整性。沉默miR-143可增強凋亡調節因子（PUMA）的活性來激活p53和核轉錄因子-κB通路以保護BBB的完整性［26］。在短暫性大腦中動脈閉塞（tMCAO）的小鼠模型及AIS患者血漿中發現circDLGAP4的表達水平顯著下降，同時miR-143表達升高，circDLGAP4是miR-143的ceRNA，過表達circDLGAP4可通過調控miR-143顯著增加HECTD的表達，從而減少神經元和BBB損傷，降低梗死面積［27］，表明circDLGAP4可以作為急性腦損傷新的生物標志物和潛在治療靶點。

1.3 circRNA作用于AIS的自噬作用自噬是細胞中一種高度保守的分解代謝途徑，其可通過溶酶體消化來降解蛋白質和恢復受損的細胞器［28］。自噬在腦缺血損傷后會被激活［29］，可保護神經元免受炎癥侵襲［30］。近年來，研究發現circRNA在調控腦缺血后星形膠質細胞自噬中起關鍵作用［31］。

星形膠質細胞是中樞神經系統中最豐富的細胞類型，通過接觸、相互作用來影響神經細胞功能，在維持中樞神經系統的內穩態中起著重要作用［32］。研究表明自噬可提高星形膠質細胞的活化，減輕腦梗死，改善神經系統評分［33］。Han等［34］發現tMCAO小鼠模型的腦缺血組織和AIS患者的血漿中circHECTD1的表達均上調，circHECTD1作為miR-142的ceRNA，敲除circHECTD1可調控miR-142來抑制TCDD誘導多聚核糖聚合酶（TIPARP）的表達，從而激活星形膠質細胞和誘導自噬，表明circHECTD1可以作為腦缺血誘導的星形膠質細胞激活的新生物標志物和治療靶點。哺乳動物體內的SIRT1能夠調節多種與自噬和增殖有關的轉錄因子的表達及活性［35］。研究發現在腦缺血期間，circSHOC2作 為miR-7670-3p的ceRNA，增 強circSHOC2的表達能夠調控miR-7670-3p/SIRT1軸誘導自噬，從而抑制神經元細胞凋亡，改善神經元損傷，有助于AIS治療［19］。

1.4 circRNA作用于AIS的神經保護缺血半暗帶、梗死周圍區域擴大和腦缺血/再灌引發的級聯反應可以延遲數小時至數天，由此在使用溶栓法的基礎上，盡早實施神經保護可以降低腦損傷，使AIS患者獲得最大的治療效益［36］。

在人神經母細胞瘤細胞和小鼠多巴胺能神經元中，過表達circDLGAP4能夠提高miR-134-5p/環磷腺苷效應元件結合蛋白（CREB）通路中的腦源性神經營養因子、B細胞淋巴瘤2和過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1α的表達，從而發揮神經保護作用［37］。腫瘤壞死因子受體相關因子3（TRAF3）是腫瘤壞死因子受體家族成員之一，其在腦缺血再灌注損傷時表達水平顯著升高，可加重神經元損傷，擴大腦梗死面積，抑制TRAF3表達對MCAO小鼠的腦組織具有神經保護作用［38］。miR-133b是多能間充質基質細胞的外泌體分泌的一種miRNA，過表達miR-133b可改善腦卒中后的神經可塑性和促進腦功能恢復［39］。在OGD誘導的小鼠海馬神經元和鼠MCAO模型中發現，circHECTD1和TRAF3表達顯著上調，miR-133b表達明顯下調，通過敲低circHECTD1靶向調控miR-133b來抑制TRAF3的表達，從而減弱由腦缺血引起的神經元損傷，起到神經保護作用［40］。此外，在局灶性腦缺血再灌注的小鼠模型中發現，腦組織中circTLK1的水平顯著增加，circTLK1作為 內源性miR-335-3p的ceRNA能夠抑制miR-335-3p活性，導致TIPARP表達增加，隨后加重神經元損傷，而敲除circTLK1后，能夠顯著降低梗死體積，減少神經元損傷，改善受損神經功能［41］，表明circTLK1的調控對AIS的神經元損傷發揮關鍵作用。Qiu等［42］發現circDLGAP4可作為miR-503-3p海綿，過表達circDLGAP4可提高神經元生長調節因子1的表達，從而減輕腦缺血期間的神經元損傷，為腦缺血提供一個潛在治療靶點。

綜上，敲低或過表達circRNAs可調節與miRNAs的結合位點，由此干預下游相關蛋白的表達，能夠修復細胞功能，改善神經元損傷，減輕神經功能缺陷。此外，除充當ceRNA外，circRNA還具有轉錄調控及RNA結合蛋白的作用［43-44］，今后可在circRNA轉錄調控及RNA結合蛋白的功能上探討對AIS發生發展的機制影響。

2 circRNA對AIS臨床診斷及預后的意義

circRNAs的熒光定量PCR和高通量測序的快速發展對探索易于獲得和快速測量的具有AIS診斷潛力的生物標志物具有重要意義。Peng等［45］發現，AIS患者外周血單核細胞中circHECTD1表達水平高于正常人，此外，受試者工作特征（ROC）曲線顯示，circHECTD1表達可用于區分AIS患者與健康人，曲線 下 面 積（AUC）為0.814；在AIS患 者 中，circHECTD1的表達與NIHSS評分、CRP和炎性細胞因子呈正相關，揭示了circHECTD1作為AIS診斷和預后生物標志物的潛力。Zhu等［46］研究170例AIS患者和170例健康人外周血單核細胞和血清中的circDLGAP4和miR-143，發現與健康人相比，AIS患者外周血單核細胞和血清circDLGAP4表達下調，而circDLGAP4的表達與miR-143呈負相關，ROC曲線分析顯示，circDLGAP4表達的AUC為0.816，對于評估AIS風險具有較好的價值;相關分析表明，AIS患者的circ DLGAP4表達與NIHSS評分和CRP水平呈負相關；此外，circDLGAP4水平也與血清中TNF-α、白細胞介素（IL）-6、IL-8和IL-22的表達呈負相關，表明circDLGAP4可作為診斷AIS的新生物標志物。

Zuo等［47］發 現，AIS患 者 與 健 康 人 比 較circFUNDC1、circPDS5B、circCDC14A的表達水平升高，circPDS5B在淋巴細胞和粒細胞中增加，而circCDC14A僅在粒細胞中升高，3個circRNAs聯合診斷AIS的AUC為0.875，特異度為0.910，敏感度為0.715，且3個circRNAs的表達水平均與梗死體積呈正相關，表明3種circRNAs的聯合可作為診斷和預測AIS的生物標志物。

3 總結與展望

circRNA作為ceRNA能夠調控AIS的細胞凋亡、細胞自噬、血腦屏障及神經保護等生物學功能，且circRNA與AIS的梗死面積、炎癥反應以及功能障礙程度密切相關，有望為防治該疾病的新藥篩選、設計或基因治療提供新的途徑和思路。盡管目前ceRNA調控網絡作用于AIS的研究較多，但仍存在問題：首先，AIS的機制較為復雜，且非編碼RNA作用的靶點有多個，存在多個通路之間相互串擾問題；其次，目前關于circRNA的ceRNA網絡調控均為AIS的細胞和動物的研究，缺乏臨床樣本研究，仍需進行臨床研究，探討circRNA介導ceRNA調控網絡在AIS的診斷及預后中的應用價值。