黃芩-連翹藥對治療重癥肺炎的作用機制探討*

戴和森，周大勇，劉穎

1 安徽中醫藥大學研究生院 安徽合肥 230038

2 安徽中醫藥大學第一附屬醫院 安徽合肥 230038

重癥肺炎是一類由社區獲得性肺炎或醫院獲得性肺炎進行性發展而來，最終導致以肺部損害為主的多臟器功能衰竭的呼吸系統危重疾病[1-2]，患者一般表現為高熱、意識模糊、低血壓等，病情嚴重時常伴有膿毒癥休克、呼吸衰竭、多器官功能障礙等危重癥狀。作為ICU常見的危重疾病，對重癥肺炎主要現代醫學以抗感染、營養支持、機械通氣等對癥治療為主[3]，但也產生了抗生素耐藥、菌群失調、免疫功能低下等副作用，且病死率仍居高不下。重癥肺炎屬于中醫學“風溫肺熱病”“喘證”，中西醫結合治療對于緩解重癥肺炎并發癥、提高患者生存質量、減少患者治療肺炎等方面存在巨大優勢[4]。黃芩味苦， 性寒，有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎的功效，現代藥理學研究表明，黃芩中含有的黃酮類成分具有很好的解熱、抗炎、抗菌抗病毒、免疫調節功效[5-8]。連翹味苦，性微寒，具有清熱解毒、消腫散結、疏散風熱等功效，現代藥理研究表明，連翹中主要成分具有很好的抗炎、抑菌、抗病毒、抗氧化等功效[9-11]。黃芩-連翹配伍在中藥及中成藥處方中都有體現，如葛根芩連湯、雙黃連口服液、牛黃上清丸等，也是治療重癥肺炎的常用藥物組合。

與西藥單成分、單靶點不同，中藥作用往往是多成分、多靶點、調節方式多樣，所以采用西藥研究思維很難科學地解釋中藥的藥效物質基礎和組方規律[12]。網絡藥理學旨在從相互關聯及關聯強度的角度研究問題[13]，利用網絡藥理學對中藥處方治療疾病的研究有獨特的優勢和巨大潛力。為更全面地探討黃芩-連翹藥對治療重癥肺炎的作用機制，本研究采用網絡藥理學方法構建、分析藥物-基因-疾病網絡和靶點蛋白交互作用（protein-protein interaction， PPI）網絡。利用分子對接方法驗證藥物活性成分與重癥肺炎相關靶點的結合活性，驗證治療重癥肺炎的可能性，為后續深入研究提供參考依據。

材料與方法

1 黃芩-連翹成分及作用靶點篩選

利用中藥系統藥理學數據庫與分析平臺[14]（TCMSP，https：//tcmspw.com）對黃芩、連翹的主要化學成分及其藥物動力學性質進行評估。 “Herb Name”以“黃芩”“連翹”作為關鍵詞，選取口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30% 和類藥性（drug likeness，DL）≥0.18的化學成分作為候選活性成分。再通過TCMSP數據庫得到藥物的潛在靶點，借助蛋白質數據庫（Uniprot，https：//www.uniprot.org/），限定物種為“Homo sapiens”，將所得的靶點信息標準化，獲取靶點的基因名。

2 疾病靶點和藥物作用靶點

利 用 GeneCards數 據 庫（https：//www.genecards.org/）、OMIM 數據庫（https：//omim.org/）檢索關鍵詞為“Severe pneumonia”，刪除重復靶點后獲得重癥肺炎相關靶點。運用Venny2.1（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）在線作圖工具繪制藥物-疾病靶點的韋恩圖，取交集作為潛在治療靶點。

3 藥物-成分-靶點網絡構建

將黃芩-連翹藥對篩選出的候選化合物及藥物與疾病共同靶點上傳至Cytoscape3.7.2軟件，構建復藥物-成分-靶點網絡，并對網絡的拓撲屬性進行分析，預測中藥主要活性成分。

4 靶點蛋白互作網絡構建

篩選得到共同靶點導入到String數據庫（https：//www.string-db.org/）中，設定物種為“homosapiens”，最低相互作用得分＞0.4，獲取蛋白相互作用TSV文件，將文件導入Cytoscape3.7.2，繪制蛋白相互作用網絡圖，并通過網絡拓撲值選出核心靶點。

5 基因本體（GO）和京都基因與基因組百科全書（KEGG）富集分析

利用R軟件Bioconductor軟件包中“org.Hs.eg.db”功能，將交集靶點轉換成enterzID。然后利用“cluster Profiler”包，導入轉換的 enterzID，以P-value＜0.05為條件對交集基因進行基因本體（geneontology， GO）功能和基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析，分析黃芩-連翹治療重癥肺炎的生物學過程（BP，Biological Process）、組成（CC， Cellular Component）、分子功能（MF， Molecular Function）和信號通路，并將富集結果前15位以氣泡圖形式可視化呈現。

6 成分-靶點分子對接驗證

通過化合物商業數據庫（ZINC，http：//zinc.docking.org/）檢索核心活性成分pdb格式作為受體，通過蛋白質數據庫（PDB，https：//www.rcsb.org/）獲取關鍵靶點的pdb格式文件作為配體，使用Autodock 1.5.6軟件對受體和配體分子進行去水、加氫處理，計算受體與配體結合能，使用R軟件“pheatmap”包對結合能以可視化呈現，使用Pymol軟件對配體和受體結合可視化呈現。

結 果

1 中藥的活性成分和潛在靶點

通過TCMSP數據庫篩選共得到黃芩中的活性成分39個，潛在靶點118個；連翹活性成分23個，潛在靶點213個。

2 疾病靶點和中藥作用靶點

通過GeneCards數據庫、OMIM數據庫，獲取重癥肺炎相關靶點2477個。將中藥靶點和重癥肺炎相關靶點導入Venny2.1在線作圖工具，獲得中藥-疾病靶點的韋恩圖，見圖1，由圖可知，黃芩、連翹之間相同靶點為90個，黃芩與重癥肺炎有78個交集靶點，連翹與重癥肺炎有149個交集靶點。

圖1 中藥-疾病靶點韋恩圖

3 藥物-成分-靶點網絡

建立中藥活性成分及靶點信息的Network文件和Type文件，導入Cytoscape3.7.2軟件構建藥物-成分-靶點網絡，見圖2，可得到一張Nodes為212（其中中藥成分節點51個）、Edges為1701的網絡。通過網絡拓撲屬性分析，見表1，中藥成分網絡度值（Degree）前10位成分分別為：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、黃岑黃素（baicalein）、beta- 谷甾醇（beta-sitosterol）、金合歡素（acacetin）、蘇薺苧黃酮（Moslosooflavone）、千層紙素 A（oroxylin a）、黃芩黃酮（rivularin），這些成分與重癥肺炎的交集靶點較多，推測這些成分可能為重癥肺炎治療的關鍵成分。

表1 中藥成分度值前15

圖2 藥物-成分-靶點網絡圖

4 PPI蛋白互作網絡

將160個共同靶點錄入String數據庫，獲取蛋白之間相互關系網絡數據TSV文件，將文件導入cytoscape3.7.2軟件，構建PPI蛋白互作網絡，并根據通過拓撲屬性分析網絡度值（Degree）、介度中心性（Betweenness Centrality，BC）和緊密中心性（Closeness Centrality，CC），進而篩選出核心靶點，見圖3。節點網絡度值前15如表2所示，其中AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF節點度值較高，推測這些靶點可能是黃芩-連翹治療重癥肺炎的關鍵靶點。

表2 PPI網絡度值前15

圖3 黃芩-連翹治療重癥肺炎PPI網絡圖

5 潛在靶點富集分析

將160個潛在靶點經R語言運行后共獲得2702條GO富集功能，其中2473個生物過程，見圖4-A，主要與對氧化應激反應、對脂多糖反應、對細菌來源反應、對藥物反應等相關。302個細胞組分，見圖4-B，主要包括膜筏、膜微孔、膜區、囊泡腔等。57個分子功能，見圖4-C，主要涉及信號受體激活劑、受體配體活性、細胞因子受體結合等。KEGG分析共富集于244條信號通路，見圖4-D，主要與白細胞介素-17信號通路（IL-17 signaling pathway）、腫瘤壞死因子信號通路（TNF signaling pathway）、C型凝集素受體信號通路（C-type lectin receptor signaling pathway）、病毒感染、癌癥通路等途徑相關。

圖4 GO生物學過程（A）、細胞組分（B）、分子功能（C）和KEGG富集分析（D）

6 分子對接結果

選取黃芩-連翹治療重癥肺炎網絡度值前10位中藥成分：槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、黃岑黃素、beta-谷甾醇、金合歡素、蘇薺苧黃酮、千層紙素A、黃芩黃酮，與PPI網絡圖度值前5的靶點進行對接，分子對接靶點為： AKT1（PDB ID：1UNQ）、IL6（PDB ID：4O9H）、TP53（PDB ID：1AIE）、VEGFA（PDB ID：1MKK）、TNF（PDB ID：5UUI），對接結果見圖 5。

一般認為結合能＜-4.25 kcal·mol-1提示配體與受體有一定的結合活性，＜-5.0 kcal·mol-1有較好的結合活性，＜-7.0 kcal·mol-1有強烈的結合活性[15]。結合圖5可知，所有成分與靶點結合能均＜-5.0 kcal·mol-1，其中beta-谷甾醇除IL-6外與靶點結合能 ＜-7.0 kcal·mol-1，結合能強烈。用 PyMOL 軟件以熊果酸為例對成分與靶點對接結果進行可視化展示，見圖6。

圖5 黃芩-連翹治療重癥肺炎的主要活性成分與主要靶點結合能熱圖

圖6 beta-谷甾醇成分與靶點對接結果

討 論

本次研究采用網絡藥理學和分子對接研究方法，利用數據挖掘技術找出黃芩-連翹活性化學成分60個，潛在靶點241個，其中與重癥肺炎交集靶點160個，發揮作用的中藥活性成分50種，GO富集分析共2702條，KEGG分析共244條，分子對接表明主要活性成分與重癥相關靶點具有穩定的結合活性。

通過對黃芩-連翹治療重癥肺炎的藥物-成分-靶點網絡網絡分析，活性較高的成分為：槲皮素、木犀草素、山奈酚等，相關研究表明槲皮素通過抑制寡聚物的形成，顯著降低了肺炎球菌溶血素（Pneumolysin，PLY）誘導的溶血活性和細胞毒性，減少PLY介導的細胞損傷，提高感染致命劑量肺炎雙球菌的小鼠的存活率，減輕肺組織的病理損傷，抑制支氣管肺泡灌洗液中細胞因子（IL-1β和TNF-α）的釋放[16]。此外，槲皮素通過促進細胞氧化應激，以及通過激活犬尿氨酸途徑減少局部L-色氨酸的可用性來限制細菌生張[17]。木犀草素可以通過抑制脂多糖（LPS）誘導的BEAS-2B細胞中miR-132的表達從而減少細胞凋亡和炎癥細胞因子的表達，從而減少LPS誘導的炎癥性損傷[18]。山奈酚可有抑制炎癥細胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β和PGE2的表達，改善肺部水腫，同時還可抑制NFκB和MAP激酶的磷酸化，在體外和體內發揮抗炎作用[19]。

PPI網絡顯示，黃芩-連翹藥對的活性成分主要通過作用于 AKT1、IL6、TP53、VEGFA、TNF等靶點發揮治療重癥肺炎的作用。Akt1與細胞代謝、生存遷移和基因表達有關，當機體發生急性炎癥時，Akt1可以通過調節血管通透性，導致水腫和白細胞外滲[20]。IL-6作為多功能炎性細胞因子，是炎性介質網絡的關鍵成份，IL-6過度合成則會導致“細胞因子風暴”[21]。TP53 是重要的抑癌基因，在調節細胞生長、細胞凋亡和 DNA 修復中發揮重要作用[22]。VEGFA是一種強效的血管生成和血管通透性因子，其水平與炎癥反應和血管內皮通透性呈正相關[23]。TNF-α能夠通過促進caspase-3活化發揮肺泡上皮細胞凋亡促進作用，從而造成肺泡上皮細胞損傷[24]。

通過分析預測黃芩-連翹藥治療重癥肺炎的通路發現，該藥對主要是通過影響IL-17通路、TNF通路等發揮作用。相關研究表明，IL-17的過度表達可以使中性粒細胞大量匯聚及炎癥因子分泌，激活炎癥反應，造成肺泡內皮損傷及組織通透性增加[25]。此外，IL-17的血清含量與急性肺損傷患者的病情嚴重程度及疾病預后都呈正相關[26]。TNF-α是由巨噬細胞分泌的炎性因子[27]，與各類炎癥反應及血管內皮通透性有關，臨床上使用阻斷TNF-α作用的藥物治療干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡和克羅恩病等炎癥相關疾病，說明了TNF在炎癥中的核心作用[28]。

本研究利用網絡藥理學和分子對接方法，初步對黃芩-連翹藥對的活性化合物、潛在的治療靶點及治療重癥肺炎的分子機制進行探討，為下一步研究提供參考。