藤黃健骨片治療骨關節炎的作用機制*

陳天鑫，聶立聰，朱瑜琪

中國中醫科學院眼科醫院 北京 100040

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種退行性骨關節疾病，＞65 歲的人群中發病率可達到50%，主要表現為關節的疼痛、腫脹和活動受限，并可導致肌肉萎縮和關節畸形，嚴重影響患者生活質量[1]。OA在中醫屬于“痹證”范疇[2]，中國歷代醫家多認為痹證的主要病因包括“風、寒、濕”三邪，可侵犯體表，阻礙經絡、氣血運行[3]。藤黃健骨片（湖南方盛制藥股份有限公司）源于名老中醫的經驗方，臨床觀察數據[4]顯示其治療OA療效顯著，不僅對局部疼痛和功能障礙有明顯改善，而且能提高患者的生活質量，幫助其恢復正常的工作和生活。研究[5]證實藤黃健骨片具有鎮痛、活血化瘀的作用。本文擬通過網絡藥理學和分子對接探討藤黃健骨片治療OA的可能機制。

資料與方法

1 藤黃健骨片活性成分的收集與篩選

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology，TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php）中分別以熟地黃、鹿銜草、骨碎補、肉蓯蓉、淫羊藿、雞血藤及萊菔子為關鍵詞，獲得藤黃健骨片中所含藥物的化學成分。目前研究認為，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%符合人體對藥物的利用程度[6]，類藥性（drug-likeness， DL）＞0.18表明該成分具有成藥性的可能[7]，因此使用ADME參數篩選可能的活性小分子時，便通過設定OB≥30%、DL≥0.18篩選獲得其最終活性成分。運用TCMSP查找篩選所得活性成分對應的靶點信息，將所得靶點信息輸入Uniprot（https//www.uniprot.org/）獲取靶點對應的基因Symbol。

2 OA相關疾病靶標的獲取

以“Osteoarthritis”作為關鍵詞，分別在GeneCards數據庫[8]（https://www.Genecards.org）、OMIM數據庫[9]（https://omim.org）、TTD 數據庫[10]（http://db.idrblab.net/ttd/）和 Drug Bank 數據庫[11]（https://go.drugbank.com/）檢索與OA相關的靶標基因，將得到的數據匯集并去重。

3 藥物-活性成分－OA疾病靶點網絡的構建

為明確藤黃健骨片與OA潛在靶點間的相互作用，將藤黃健骨片活性成分對應的靶點與OA靶點基因導入Venny網站（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/），并繪制交集靶點的韋恩圖。借助 Cytoscape3.7.2 軟件把靶點蛋白構筑“藥物-活性成分-疾病靶點”網絡并進行分析。

4 構建交集靶點蛋白互作網絡（PPI）和獲取關鍵靶點

為進一步了解靶點之間的相互作用，明確關鍵靶點，將交集靶點輸入String 數據庫進行檢索，設定物種為“Human”（人類），在設置中設定“Highest confidence”0.9，其余設定不變， 獲取交集靶點互作網絡（PPI），并導出網絡的TSV格式文件，將其導入Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化處理；通過Degree值得到關鍵靶點。

5 進行GO功能富集和KEGG通路富集分析

將交集靶點導入Metascape數據庫（http://metascape.org/gp/index.html）進行GO功能富集分析（包括分子功能（molecular function，MF）、細胞成分（cellular component，CC）、生 物 過 程（biological process，BP）和 KEGG通 路 富 集 分 析，并 運 用GraphPad Prism軟件對分析結果進行可視化處理，以體現藤黃健骨片治療OA的主要作用通路。

6 分子對接與最低結合能圖的構建

使用Pubchem數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）查找藤黃健骨片關鍵活性成分的3D結構，并導入autodock軟件進行能量最小化處理；并利用RCSB PDB數據庫（http://www1.rcsb.org/）查找關鍵靶點的蛋白結構3D結構，結果導入autodock軟件，通過去水、加氫、加電荷處理；將處理后的活性成分和靶點相關蛋白在AutoDock Vina軟件[12]進行分子對接，并計算最低結合能，將最低結合能最低的一組通過Pymol 2.4.0軟件進行可視化處理。

結 果

1 藥物活性化合物及篩選靶點結果

通過TCMSP平臺共收集到藤黃健骨片化合物478個，熟地黃96個，鹿銜草36個，骨碎補71個，肉蓯蓉25個，淫羊藿130個，雞血藤68個，萊菔子52個。以DL≥0.18、OB≥30%為篩選條件，共篩選出85個具有較高活性的化合物，分別是熟地黃2個，鹿銜草9個，骨碎補18個，肉蓯蓉6個，淫羊藿23個，雞血藤24個，萊菔子3個，去重后得到70個化合物的活性成分；利用UniProt數據庫對有效成分進行靶點基因注釋，并刪去無法獲得基因symbol與重復的靶點，共得到251個藥物靶點。

2 OA疾病靶點結果

在GeneCards數據庫、OMIM數據庫、TTD數據庫和DrugBank數據庫檢索OA疾病相關靶點共1305個，去重后共1015個疾病靶點。

3 繪制藥物-活性成分-疾病靶點圖

運用Cytoscape 3.7.2軟件構建藤黃健骨片治療OA的藥物-活性成分-疾病靶點共表達網絡圖，見圖1，其中綠色菱形代表疾病靶點，紅色圓形代表藥物，六邊形代表各藥物活性成分，A1、A2、B1、B2、B3、B4、C1、C2代表藥物共有活性成分，見表1。根據藥物-活性成分-疾病靶點共表達網絡圖可得出Degree值前五的活性成分分別是quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、luteolin（木犀草素）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）和Stigmasterol（豆甾醇）。網絡圖說明同一藥物活性成分對應于不同的作用靶點，同一靶點也可對應于不同的藥物活性成分，顯示出藤黃健骨片治療OA多成分、多靶點的特點。

表1 各藥物共有活性成分表

圖1 藤黃健骨片治療OA的“藥物-活性成分-疾病靶點圖”

4 交集靶點蛋白互作網絡（PPI）和關鍵靶點結果

將藥物活性成分對應的靶點與疾病靶點基因導入Venny網站，并繪制交集靶點的韋恩圖，見圖2，得到二者交集基因共117個。將交集基因導入String數據庫檢索獲取PPI網絡圖，在設置中設定“Highest confidence”0.9，得到109個靶點，并導出TSV格式文件，用Cytoscape 3.7.2 軟件進行可視化處理，見圖3，其中顏色越紅，面積越大代表degree值越大。根據degree值排名，取前十名為關鍵靶點見表2。

圖3 藤黃健骨片與OA共同靶點PPI網絡圖

表2 藤黃健骨片治療OA關鍵靶點信息表

圖2 藤黃健骨片活性成分靶點與OA疾病相關靶點映射的韋恩圖

5 GO功能富集和KEGG通路富集分析結果

通過將117個交集靶點導入Metascape數據庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，以P＜0.01進行篩選，一共得到2171條生物過程，包括對有毒物質的反應（response to toxic substance）、對無機物的反應（response to inorganic substance）、對脂多糖的反應（response to lipopolysaccharide）細胞對有機環狀化合物的反應（cellular response to organic cyclic compound）、對細胞外刺激的反應（response to extracellular stimulus）等，其中前20條見圖4，KEGG分析共得到320條信號通路，包括癌癥通路（Pathways in cancer）、糖尿病并發癥中的AGE-RAGE信號通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、IL-17信 號 通 路（IL-17 signaling pathway）、蛋白聚糖在癌癥中（Proteoglycans in cancer）等，其中前20條見圖5。為了直觀反映靶點和信號通路之間的聯系，對藤黃健骨片治療OA關鍵通路作了“靶點-信號通路”網絡圖，其中黃色代表信號通路；綠色代表靶點，見圖6。

圖4 GO分析的Top20生物過程圖

圖5 KEGG分析的Top20信號通路圖

圖6 藤黃健骨片治療OA的“靶點-信號通路”圖

6 分子對接結果與最低結合能圖

將關鍵活性成分quercetin（槲皮素）、kaempferol（山奈酚）、beta-sitosterol（β-谷甾醇）、luteolin（木犀草素）與關鍵靶點IL-6、TP53、TNF和PTGS2分別進行分子對接并計算最低結合能，結果見圖7，其中PTGS2與木犀草素、β-谷甾醇的最低結合能最低，均為-9.3kcal·mol-1，選取PTGS2與木犀草素的分子對接結果進行可視化處理，結果見圖8。

圖7 藤黃健骨片治療OA重要活性成分與關鍵靶點分子對接最低結合能圖

圖8 活性成分木犀草素與關鍵靶點PTGS2分子對接圖

討 論

槲皮素、山奈酚、木犀草素和β-谷甾醇可能是藤黃健骨片中的關鍵成分。研究[13]表明：槲皮素通過抑制軟骨細胞的炎癥和凋亡，發揮軟骨保護作用。其通過激活SIRT1/AMPK信號通路抑制內質網應激[14]。體內及體外實驗[15-17]表明：槲皮素能通過干擾NF-κβ信號通路明顯降低IL-1β、TNF-α、IL-6等細胞因子的表達，保護關節軟骨。山奈酚通過抑制NF-κB途徑，顯著降低白細胞介素1β刺激的大鼠OA軟骨細胞促炎介質的表達，從而預防、停止或延遲OA的發展[18]，Huang等[19]研究顯示山奈酚的抗炎作用是通過抑制絲裂原激活蛋白激酶相關的細胞外信號調節激酶和P38信號通路介導的，能顯著抑制IL-1β誘導的炎癥介質蛋白的表達。木犀草素能顯著降低IL-1β誘導的NO、PGE2等的生成以及COX-2、iNOS等的表達，防止OA大鼠的軟骨破壞和增強II型膠原的表達[20]。木犀草素能有效減輕炎癥反應，保護軟骨細胞，延緩軟骨變性[21]。β-谷甾醇等植物甾醇具有抗炎癥、抗氧化和調節人體相關激素等多種生理作用[22]。

IL-6、TP53、TNF和PTGS2可能是治療OA的潛在靶點。IL-6在OA關節內產生，并在OA的發病機制起重要作用[23]，IL-6主要通過Stat3信號傳導誘導軟骨細胞分解代謝，系統性阻斷IL-6可減輕二甲基甲酰胺誘導的小鼠OA[24]，IL-6過量的產生已被證明與老年人膝關節軟骨丟失密切相關[25]；P53是一種腫瘤抑制基因，主要作用是在G1期或S期停止細胞周期，從而修復受損細胞[26]，zhu等[27]認為P53上調可能促進軟骨細胞凋亡在KOA的進展。TNF是觸發關節軟骨合成代謝和分解代謝失衡的介質，能刺激MMP-1、MMP-3和MMP13的釋放，抑制OA中蛋白聚糖Ⅱ型膠原的合成[28-29]。PTGS2是炎癥性PG生物合成的關鍵酶之一，可能是潛在的炎癥性生物標志物[30-31]，有研究也發現了在人類OA軟骨細胞中高表達的PTGS2[32]，其過度表達損害蛋白聚糖的合成，增強軟骨中對Ⅱ型膠原和軟骨聚集蛋白聚糖的降解[33]。

IL-17信號通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路可能是治療OA的關鍵通路。IL-17是關鍵炎癥細胞因子，在自身免疫性疾病和組織炎癥中起著關鍵作用[34]，阻斷IL-17信號通路可以有效預防及治療OA[35]。HIF - 1α是低氧反應的主要調節因子之一，在骨建模、骨重塑和穩態中發揮重要作用。其通過激活JAK2/STAT3通路增強破骨細胞的分化[36]；了解參與HIF-1α信號通路的多態性之間的相互作用，可以為識別膝骨性關節炎高危人群提供新的診斷支持工具[37]。JAK/STAT信號的激活對于使OA發展為滑膜關節衰竭的慢性炎癥狀態持續存在至關重要[38]。Lim等[39]研究發現阻斷該信號通路可能在軟骨退變中具有軟骨保護作用。

本文通過網絡藥理學和分子對接探討藤黃健骨片治療OA的機制，發現藤黃健骨片中的槲皮素、木犀草素、山奈酚和β-谷甾醇等很可能通過 IL-6、TP53、TNF和PTGS2等靶點作用于IL-17信號通路、HIF-1信號通路、JAK-STAT信號通路，從而發揮治療OA的作用。但是由于數據庫不夠完整、不同算法預測的結果不同等原因[40]，網絡藥理學仍然有很大的局限性，需要基礎實驗和臨床研究對結果進一步驗證。