中藥藥用活性成分的生物合成研究進展

李清清 劉志齋張潔 徐德林?

（1.遵義醫科大學， 貴州 遵義563099； 2.西南大學農學與生物科技學院， 重慶400715； 3.四川省農業科學院生物技術核技術研究所， 四川 成都610061）

中醫藥是我國的瑰寶，在我國數千年的歷史長河中對人類的健康有著決定性作用。中藥防治和干預疾病時發揮作用的物質基礎就是藥用植物中的藥用活性成分，這些活性成分主要包括生物堿類、甾體類、多酚類、萜類等，是植物進行次生代謝產生的復雜化合物，也是中藥治療疾病的根本。在植物細胞、組織等的分化與完善過程中，這些次生代謝產物在特定的部位逐漸積累，但是總含量較低，因而入藥部位少，藥用成本高。采用化學法合成植物的復雜次生代謝產物，存在合成步驟繁瑣、合成成本高、環境不友好等缺點，使得藥用植物生物活性成分無法大量人工合成。而合成生物學方法具有高效、經濟、穩定、綠色環保、周期短等優點，是現代新藥的創新途徑，具有獨特的優勢和發展潛力。合成生物學的發展為藥用植物活性成分的研究注入新的動力，對于藥用植物活性成分的生物合成研究也取得了巨大進展，本文對藥用植物活性成分在合成生物學上的研究進展做概括介紹，以期為進一步研究提供理論依據。

1 中藥藥用活性成分

藥用植物的治療潛力是由于其存在一些生物活性成分，如單寧、萜類、生物堿、類黃酮等小分子化合物。單寧具有收斂、消炎、止瀉、抗氧化、抗菌等生理活性，可加速傷口和發炎黏膜的愈合。萜類化合物存在多種類別，有單萜、二萜、倍半萜等，大多具有清除自由基、消除炎癥、防治腫瘤、降血糖、抗膽堿酶等活性，對預防和治療癌癥、減少炎癥發生、治療呼吸道疾病、治療糖尿病等都有重要價值。生物堿具有防治瘧疾、哮喘、癌癥、心律失常、高血糖、鎮痛等作用，在傳統和現代醫學中廣泛使用，亦可作為藥物發現的起點。有些生物堿還是興奮劑類精神活性藥物，可用于創傷治療。類黃酮也具有抑菌、抗病毒、防治癌癥、清除自由基、延緩衰老、預防心血管疾病、止痛、鎮痛等作用。

中藥起作用的根本保證是藥用活性成分，這些活性成分也是開發新藥的源頭［1?2］。藥用活性成分結構復雜、含量少，化學方法合成難度大，甚至會破壞生態環境，而且許多中藥材的生長還受土壤、季節等生態環境因素限制，部分珍稀中藥材的生長周期長，其活性成分更是無法大量獲取，科研和新藥的大量需求是傳統提取方法或化學合成法無法滿足的，合成生物學方法將有效解決這一矛盾［3］。

2 合成生物學應用于藥用活性成分富集的研究概況

合成生物學是21 世紀新興的一門學科，是在基因工程、代謝工程等學科的基礎上形成的整合學科。合成生物學以生物學為基礎，融入工程學的模塊化與系統設計理念，以達到人工改造并優化生物合成過程中有關的生物元件，或者合成全新的具有定向性能的新生物體的元件、器件或模塊，設計更加系統穩定的生物體系的目的。由此形成的合成生物體系將在能源、醫學、材料、環境、天然化合物等領域達到規模化應用。合成生物學是生命發展過程中人類第1 次將生命科學工程化的學科［4］。合成生物學的內容包括合成生物學系統的設計與組裝、調控與優化，在生物合成系統設計上主要包括底盤細胞的選擇、合成生物系統所需元件和途徑挖掘、計算機輔助的設計與分析、生物合成系統的構建與組裝等方面。系統的調控優化主要是在基因組水平上的全局優化以及單點的調控與優化，系統優化包括單一基因的優化、多基因途徑的組合優化、基因組簡化和重構、生物合成系統的分析與篩選、“設計→構建→檢驗→重設計”的特征循環等方面。

生物合成是生物體內同化反應的總稱，具有不同的生理意義，包括①提供生物體生長發育和繁殖所必要的物質；②在正常狀態下，對消耗掉的物質進行補充；③為長期和短期的貯藏進行必要的合成。生物合成有由主要原料進行從頭合成的全合成途徑（如光合作用等），也有可逆性的廢物利用途徑，由部分分解產物合成（如嘌呤核苷酸的轉換）。生物合成的各個途徑之間可能存在相互作用，在生物體中受到復雜的調控［5］。

生物合成通過標準化的生物模塊，構建起具有詳細生物學特征的元件后轉入底盤細胞，通過重新構建代謝合成途徑，實現定向高效的異源合成，使代謝工程的改造效率大幅提高，亦可使生物學系統變得更加豐富［6］，具有標準性、簡便性的特點。合成生物學策略主要有4種，分別為①表達目標產物，即通過微生物宿主使目標產物的基因實現異源表達；②改進生物合成途徑，即將新的生物元件或基因引進生物合成途徑，重新組織構建或延伸原有的生物合成途徑；③雜合生物合成途徑在合適的底盤細胞中的表達；④人工設計構建目標化合物的基因，在合適的底盤細胞中完成基因的表達［7］。底盤細胞即人為在細胞中構建生物系統，使其具有特定功能的細胞，如大腸桿菌、煙草細胞等一些微生物和植物細胞。

基于合成生物學的特點，天然產物尤其是有明確藥理活性的單體化合物的研究，在合成生物學出現后獲得了全新的機遇。中藥藥用活性成分的大量獲取在極大程度上可依賴合成生物學，其在藥用活性成分生物合成中的操作包括選擇優良的底盤細胞并對其進行改造（如敲除細胞中的冗余基因、將基因組整合到底盤細胞中人為組裝構建新的目標產物合成途徑、對合成代謝網絡進行調控、通過宿主細胞構建異源合成途徑等），進行系統優化并結合發酵工程技術，實現藥用活性成分的定向高效合成（如青蒿素的微生物細胞工廠生產等）［8］。目前，許多研究已經通過DNA 重組技術順利構建擁有高附加值的微生物工程菌株，包括紫杉醇前 體［9］、丹參酮［10］、人參皂苷［11］、阿 片類［12］、姜黃素［13］、鼠尾草酸［14］等化合物。形成一套藥用植物合成生物學研究策略［15］，實現目標化合物的高效生產，從而滿足人們對藥用植物資源中活性成分的大量需求，這將對藥用植物資源的可持續利用，提升我國研發創新性藥物的能力和國際醫藥產業的核心競爭力都有很大幫助。

3 中藥藥用活性成分生物合成中的關鍵技術

3.1 基因元件的設計改造 基因元件是具備特定功能的核苷酸序列，是生物體中最基本、最簡單的單元，包含啟動子、增強子、功能蛋白、酶編碼基因等，對基因的表達調控有非常重要的意義。這些元件在天然生物中分離得到后，經過人工組合、完善、優化后可得到新的生物元件。李雷等［16］通過易錯PCR 法對啟動子進行突變，結合基因改組的蛋白工程技術，改造釀酒酵母的TEFl 啟動子，建立突變啟動子庫，得到一系列強度不同的突變啟動子。簡單的生物元件還可以通過多種多樣的組合，在更大規模的設計中形成復雜的具有特定功能的生物元件和裝置。例如將效應結構域、RNA 發卡結構和單鏈RNA 結合蛋白進行組合獲得新的功能元件，實現對基因功能的調控［17］。通過基因編輯技術對生物體中基因元件進行精確的修改編輯，也可獲得具有新功能的生物元件，例如鋅指核酸酶（ZFN），即為工程化體內具有DNA 序列結合特異性鋅指蛋白結構域和核酸內切酶FokⅠ結構域構建新的可識別特異序列的核酸酶［18］，而現在只有丹參酮［19?21］、紫杉醇［22?23］、青 蒿素［24?25］、人參皂苷［26?27］等少部分藥用活性成分的代謝通路研究比較透徹，大多數藥物活性成分的代謝途徑還在研究和發現中，隨著中藥藥用活性成分相關途徑的不斷解析，應用于合成生物學的基因元件也將得到補充。因此，目前研究的重要任務之一是對相關生物合成途徑的解析以及基因調控元件的發掘。

3.2 底盤細胞的選擇和改造 合成生物學可以使底盤細胞具有人類需要的特定生物功能，這些底盤細胞除了要具備自我復制和代謝能力，還應具備生長周期短、遺傳背景清晰、易于培養、能通過人工設計調控元件優化原有代謝網絡提升合成效率等特征。近年來，大腸桿菌、藍細菌、釀酒酵母、煙草細胞等微生物和一些植物被廣泛用作異源合成的底盤細胞，實現目標產物的高效合成以及某些特定類型的化合物合成，如以酵母為底盤細胞異源合成丹參酮［10］、以煙草細胞為底盤合成青蒿素［28］。

一般來說，底盤細胞本身不能進行繁復的次生代謝，必須對相應底盤細胞的代謝網絡施行優化，才能實現目標產物的異源合成。為了解除合成途徑中的某些制約，增加目標產物合成效率，有2 種策略可以對合成代謝網絡進行改造優化，一種優化方式是“自上而下”地從頭合成基因，另一種方式是“自下而上”地逐步敲除冗余基因［29］。

構建異源合成系統的過程中，異源合成途徑時常會導致某些有毒中間物的積累，制約合成產物的輸送，使代謝途徑中能量流動不均勻，目標產物合成過程中沒有適合的前體供給，嚴重擾亂底盤細胞原有的生命活動。因此，底盤細胞的優化關鍵在于分配好目標產物合成過程中的物質、信息和能量，實現產物合成和運輸的優化。隨著組學技術的發展，釀酒酵母、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌等物種的全基因代謝網絡模型［30］被建立，通過代謝網絡通量分析的方法模擬預測底盤細胞的代謝網絡，進而使目標產物的合成得到優化［31］。對底盤細胞基因組的改造賦予了細胞工廠全新的生物學功能和發展前景，如大腸桿菌等基因組的人為重建和優化［29］，不僅對基因組的結構、功能、相互作用等研究有了新的認識，也為構建復雜天然化合物的細胞工廠提供指導，從而選擇最佳的底盤細胞代謝合成途徑，實現目標產物的合成優化。

3.3 代謝途徑的構建策略 生物體代謝途徑是由酶催化的復雜動態平衡網絡，中藥合成生物學中有2 種構建代謝途徑的策略用于合成藥用活性成分。一種是在已經闡明的生物合成代謝途徑上，對原本存在的代謝途徑進行重新構建和工程化，這又可以分為3 個層次［32］，分別為①通過底盤細胞本身的前體供應途徑，應用基因工程技術生成目標產物；②通過模塊化的設計理念和基因工程原理，定向改造并優化合成路徑，結合底物調控模塊使目標產物高效合成；③對代謝網絡的調控，通過可拆卸的基因調控元件構建不同的活性模塊，優化模塊中的元件［33］，組裝形成不同的代謝調控網絡［34］，將復雜的生物合成途徑變得工程化。另一種策略是設計構建一條全新的藥用活性成分合成途徑，根據目標物的化學結構從基因數據庫中將相應酶基因篩選出來，人為改造并導入底盤細胞，可在底盤細胞中程序化形成一條新的異源代謝途徑。

3.4 生物合成工藝的優化 目標化合物的代謝途徑并不是一成不變的，而是相互交錯而成的動態平衡網絡，需要在已有代謝途徑的基礎上整體進行改進與創新，提高目標產物的合成率，這可從3 個方面進行［32］，分別為①優化生物合成路線，提高工程菌株生物合成途徑的效率，方法包括增加前體的供應、增加生物合成路徑所需底物的絕對總量以及提高藥用活性成分合成的特定途徑中的單個基因的表達效率和途徑酶的工作效率；②減少或限制競爭代謝途徑流入，使相對多的底物進入藥用活性成分合成的特異代謝途徑；③生物合成代謝網絡的整體調控，主要方法是結合生物信息分析，以一種系統的觀點對合成途徑中的調控進行數學描述，反應代謝網絡中的控制，如代謝流控制分析、代謝流量優化等。中藥藥用活性成分對細胞大多都有一定的毒性，對細胞進行全轉錄調控可以有效提高細胞性能［35］，增加產物對細胞的耐受性，有利于整個代謝網絡的協調，同時增加藥用活性成分的生物合成。

4 常用藥用活性成分的生物合成研究概況

中藥活性成分多屬于植物次生代謝產物，類型較多，有4 條主干合成途徑，分別為莽草酸途徑、氨基酸途徑、乙酸?丙二酸途徑（AA?MA 途徑）、甲戊二羥酸途徑（或稱賈瓦龍酸途徑，MVA 途徑）。

4.1 生物堿的生物合成 生物堿是生物體內次級代謝產生的一大類復雜的含氮有機化合物，主要有多烴類、莨菪烷類、嘌呤類、托品烷類等多種結構類別，其中托品烷生物堿具備抗膽堿等多種生物活性，主要是茄科、毛茛科等雙子葉類高等植物次級代謝產生的一類復雜化合物，具有悠久的藥用歷史。植物中腐胺是托品烷生物堿合成的前體，以鳥氨酸或精氨酸開始，經過相應酶的催化最終合成腐胺，這2 條腐胺的生物合成途徑已經得到闡明［36］。這2 條途徑在不同植物中對產物合成的貢獻不同，但其合成的次生代謝產物都具有物種特異性。托品烷生物堿的生物合成途徑也已有部分得到解析，N?甲基?腐胺轉移酶（PMT）是托品烷生物堿合成途徑中起作用的第一個酶，其是否為限速酶與物種有關。經N?甲基腐胺氧化酶（MPO）催化最終可形成在各代謝途徑中發揮中心作用的活性N?甲基?△1?吡咯啉正離子，可以在植物體中參與一些反應生成托品酮，它是合成莨菪堿的前體，也是托品烷生物堿途徑特有的二環結構。托品酮還原酶分為托品酮還原酶Ⅰ、托品酮還原酶Ⅱ，它們的酶活性可以直接影響托品烷生物堿的含量，也可以通過影響底物托品酮含量間接地影響托品烷生物堿的含量，這2 種托品酮還原酶的酶活性還會使代謝流的走向受到調控［37］。生物體內存在的其他代謝途徑也會調控托品烷生物堿的生物合成，人為對相關信號途徑進行設計改造也可能會間接地調節托品烷生物堿的合成和積累［38］。

托品烷生物堿生物合成途徑中的相關反應步驟以及涉及到的酶基因尚未完全研究清楚，例如1?甲基?△?吡咯啉正離子生成前體托品酮的反應是如何進行的？苯丙酮酸生成苯乳酸是如何還原的以及限速步驟和限速酶都有哪些？雖然不同植物中對托品烷生物堿合成的調節是物種特異的，但是所有植物中的托品烷生物堿天然合成途徑卻是相同的。托品烷生物堿生物合成途徑中的基因片段、關鍵酶、代謝網絡調控機制以及轉運機制等還有待進一步探索，目前相關的研究工作正在積極有序地開展。

4.2 萜類化合物的生物合成 萜類化合物是以C5為基本結構單元的化合物及其含氧和不同飽和程度的衍生物，包括類胡蘿卜素、紫杉醇、丹參酮等，是中草藥中重要的化合物，萜類化合物的通用合成途徑已經基本闡明［39］。類胡蘿卜素是萜類化合物的代表之一，研究發現，大腸桿菌4?磷酸甲基赤蘚糖醇（MEP）途徑的5 個基因（dxr、ispD、ispE、ispG、ispH）中，過表達ispG下游的ispH基因可以使β?胡蘿卜素產量提高73%，ispG、ispH基因的協同表達是MEP 途徑中重要限速步驟之一［40］，該研究對解析MEP 途徑的調控機制和通過微生物細胞工廠大量生產萜類化合物具有重大意義。

紫杉醇是紅豆杉Taxus baccataLinn.次生代謝產生的二萜類化合物，具有高效、低毒的特點，且抗癌活性良好。紫杉醇的生物合成大致可以分為3 個步驟［28］，分別為①紫杉烷環母核的合成，植物中所有萜類合成的共同代謝前體是異戊二烯，沿著異戊二烯代謝途徑先合成紫杉烷骨架［紫杉?4（5），11（12）?二烯］，該步驟以4 個異戊二烯分子縮合生成的雙（牻牛兒基）二磷酸鹽（GGPP）作為起點，反應酶為紫杉二烯合成酶，最后環化為紫杉二烯；②骨架上的官能團反應，在紫杉二烯骨架上的相應位點發生羥基化等一系列的官能團反應，最終生成化合物巴卡亭Ⅲ，它作為直接前體參與到紫杉醇的代謝合成途徑中；③合成紫杉醇的側鏈，側鏈在氨基變位酶的催化下生成，卻是分2 步連接的，在酰基轉移酶的催化下先形成N?苯甲酰紫杉醇，再經過羥基化修飾和苯甲酰化修飾生成紫杉醇。關于紫杉醇詳細的合成過程和反應機理以及相關酶基因還沒有研究完全，要通過生物合成實現大量生產紫杉醇還要不斷努力。目前，通過紫杉醇的抗腫瘤生物活性，研制出了很多新型制劑，包括聚合物膠束、納米顆粒、藥物前體等［41］，但在療效方面還有待提高。

丹參酮是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.中的一種有效成分，是二萜醌類化合物，與其他二萜類化合物一樣，以MEP 途徑或MVA 途徑這2 條萜類化合物通用前體合成途徑為起點，參與其中的重要酶包括一系列的焦磷酸合酶、細胞色素P450 家族蛋白CYP76AH1等，中間產物包括共同前體GGPP、半日花二烯／古巴基二磷酸酯（CPP）、丹參酮二烯、鐵銹醇、次丹參酮等，最后合成丹參酮類化合物［42］。在認識生物合成途徑的基礎上，熊丙全等［43］以茉莉酸甲酯為誘導子，研究丹參毛狀根毛中次生代謝途徑的調控，結果表明，誘導后丹參酮Ⅰ的含量提高到1.53倍，丹參酮ⅡA的含量提高到1.16 倍；丹參中的另一種活性成分酚酸類化合物，相比于未誘導時，迷迭香酸的含量提高到1.37倍，丹酚酸B 的含量提高到4.43倍，提示茉莉酸甲酯參與丹參毛狀根中丹參酮類化合物代謝途徑的調控，對丹參酮類和酚酸類活性成分的積累具有正效應。Guo 等［10］對丹參酮的生物合成途徑進行研究，通過比較轉錄組學等技術篩選得到2 個細胞色素氧化酶P450 基因（CYP76AH3、CYP76AK），將這2 個功能基因引入設計好的底盤細胞中，得到的酵母工程菌株能同時產生6 種二萜類代謝產物，這為生物體中丹參酮生物合成途徑的闡明、代謝網絡的調控、關鍵酶基因的研究、微生物細胞工廠生產等奠定基礎。Shi 等［44］研究表明，從丹參（原變種）Salvia miltiorrhizaBunge 毛狀根中克隆了2 個新基因SmJAZ3、SmJAZ9，這2 個基因在代謝途徑中調控丹參酮的生物合成，在茉莉酸信號途徑中起抑制性轉錄調節劑的作用。Pei等［45］提出SmJAZ8 基因作為茉莉酸誘導的丹酚酸和丹參酮生物合成中負反饋回路控制器的新作用，SmJAZ8 基因的遺傳轉化改變了其他SmJAZ基因的表達，表明在茉莉酸調控的次級代謝中發生串擾跡象，為將來詳細研究其分子機制打下基礎。張建紅等［46］采用RT?PCR 法、生物信息學分析、遺傳轉化、化學檢測、代謝組學分析等研究過表達丹參毛狀根中SmCYP81C16 基因，結果表明，SmCYP81C16對丹參酮的生物合成有正向調控作用，為丹參酮類化合物的高效生物合成奠定基礎。

4.3 黃酮類化合物的生物合成 黃酮類物質是自然界中絕大多數植物都含有的一類含氧雜環的化合物，對植物的生長發育、抗菌防病等有重要作用，其基本碳骨架為C6?C3?C6，在植物中通常和糖結合形成苷類，是一種復雜的次生代謝產物［47］，此類物質具有抗氧活性、抗病毒能力、抗血管硬化、免疫調節、降低血糖、防治腫瘤等藥理活性，甚至有些具備抗HIV 病毒的生理活性［48］。目前發現的黃酮類化合物已經多達4 000種，是許多中草藥的活性成分［49］。

黃酮類化合物的生物合成途徑以苯丙氨酸為起點，特點是具有2 個苯環，由中央3 個碳原子相互連接生成二氫黃酮類具有C6?C3?C6結構的基本骨架，通過分支途徑合成黃酮、花色素等。Zhang 等［50］以番茄作為底盤細胞構建黃酮類化合物的異源合成途徑，將擬南芥中AtMYB12 等基因進行過表達，將黃酮醇等化合物的含量增加到100 mg／g。Li 等［51］以大腸桿菌為底盤細胞人為設計一條黃酮合成途徑，通過表達PAL、FNSI、4CL以及短SbF6H等不同物種的基因，使黃芩素、野黃芩素含量達到8.5、47.1 mg／L。通過對合成途徑進行優化，提高丙二酰輔酶A 的利用率，使黃芩素、野黃芩素含量增加到23.6、106.5 mg／L，為黃酮的生物合成提供新的方式。何江等［52］對新塔花中黃酮類化合物的代謝通路進行分析，發現PAL、CHS、CHI、FNS這4 個基因在合成過程中起重要調控作用，為研究黃酮類化合物生物合成途徑中的其他酶基因奠定基礎。酶學研究方法和同位素原子示蹤法等科學方法的發展應用將推動黃酮類次級代謝產物的生物合成途徑的解析、途徑酶以及調控網絡。

5 展望

本文基于紫杉醇、丹參酮、黃酮等藥用活性成分生物合成途徑的闡明和基因的研究進行綜述，發現通過底盤細胞構建生物合成途徑能夠合成一些重要的中間代謝產物或前體物質，使得藥用植物次生代謝產物的產量都有不同程度的提高，體現出合成生物學技術的優勢。但是這些活性成分有著復雜的合成步驟，至今尚未完全解析。隨著合成生物學的發展，中藥活性成分的生物合成途徑、調控機制不斷被闡明，相關轉錄調控因子、P450 酶等基因元件的研究也在不斷深入，這將為藥用活性成分的細胞工廠生產提供新的策略和生物元件，對藥用活性成分的生物合成具有重大意義。藥用活性成分的生物合成在產業化生產方面有很大上升空間。隨著分子生物學技術、計算機技術等的發展，通過合成生物學技術進一步挖掘中藥活性成分，進而實現藥用活性成分的大量合成，為傳統中藥注入新的活力，提升我國研發創新性藥物的能力和國際醫藥產業的核心競爭力。