miR-155通過調節IL-21受體參與特應性皮炎的發病機制初探

葛維維 吳黎明 陳再明 廖米榮

特應性皮炎（AD）是一種常見的慢性復發性炎癥性皮膚病，通常發生在嬰兒早期，AD發病歸因于環境因素、宿主易感基因、免疫系統失調等多因素相互作用［1］。MicroRNA（miRNA）是一類小的非編碼 RNA，參與機體眾多生物學過程［2］。人T輔助細胞系Jurkat是近年來發現的CD4+T細胞亞群［3-4］，其可能參與包括AD在內的多種自身免疫性疾病發病過程［5］。既往研究揭示眾多miRNA在免疫和炎性疾病中的作用，其中miR-155可通過下調細胞毒性T淋巴細胞抗原4（CTLA-4）增加T輔助細胞增殖反應，從而導致慢性哮喘發病［6］。產生白介素（IL）-21的T輔助細胞（Th21）是最近鑒定出的CD4+T輔助細胞亞群，在調節免疫系統中起重要作用，并參與包括AD在內的各種自身免疫和炎性疾病［7-8］。動物實驗研究顯示，缺乏miR-155的小鼠無法發展為實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE），而在膠原誘導的關節炎模型中，miR-155敲除小鼠對抗原特異性Th21細胞反應具有抗性［9］。本研究探討miR-155是否通過調節IL-21受體參與AD的發病，為AD的治療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年1月至2020年5月臺州市第二人民醫院急性AD患者110例為觀察組，根據Rajka定義的標準確診，并使用SCORingAD（SCORAD）指數評估疾病的嚴重程度。納入標準：①近6個月未接受過全身性糖皮質激素及免疫抑制劑治療；②近1個月AD患者無疫苗接種；③近2周無感染。排除標準：①合并腫瘤者；②合并自身免疫性疾病；③其他皮膚病。同時選取健康體檢者102例為對照組。兩組一般情況比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。本項目經醫院倫理委員會批準，所有受試者及家屬知情同意。

表1 兩組一般情況比較

1.2 方法 （1）外周血Jurkat細胞miR-155、IL-21R mRNA水平測定：通過Ficoll-Hypaque密度梯度離心從500 μL外周血中分離出Jurkat細胞，使用RNAiso Plus提取Jurkat細胞RNA，并在20 μL反應系統中使用Trans Script Green一步qRT-PCR SuperMix通過一步qRT-PCR檢測基因的相對表達，qRT-PCR反應條件為：45 ℃，5 min ；94 ℃，30 s；（94℃，5 s；60℃，30 s）×40個循環，用2-△△Ct法分析靶基因表達量。（2）外周血CD44、IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP、Th21測定：流式細胞儀（AttuneNxT，美國熱電）檢測CD44、Th21細胞占總淋巴細胞的比例（抗體購于上海玉博生物科技有限公司，批號：5632456、8546296），相應試劑盒評估參與者外周血中IL-4、IL-10、TNF-α、hs-CRP的水平（MSKBIO中國，武漢），使用Multiskan Sky酶標儀檢測樣品光密度值。（3）細胞復蘇培養及分組：在含有10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI-1640（美國Gibco）培養基中培養Jurkat細胞，根據制造商的說明，用lipofectamine 2000（美國Invitrogen）轉 染Jurkat細 胞。miR-155 NC組、miR-155 mimics組、miR-155 inhibitor組培養方法：miRNA載體包括miR-155 NC載體（無miR-155表達）、miR-155過表達載體（mimics），miR-155低表達載體（miR-155 inhibitor組）（購自RiboBioCo，中國廣州）。其載體序列分別為：5'-TGCGTGACTGAACTGACTGGACTGAC TG-3'；5'-TGCGTGACTGCAATGCGTGACTGC-3'。使用Lipofectamine2000試劑根據質粒進行差異轉染，各組設6個平行樣，培養72 h。（4）Jurkat細胞活力、凋亡測定：將細胞以1×103/孔的濃度鋪在96孔板上，庫爾特計數器孵育1天后對細胞數進行計數，并使用細胞計數試劑盒8（CCK-8）計算細胞增殖率，酶標儀檢測490 nm吸光度評估細胞活力。通過胰蛋白酶消化收集細胞，并根據說明將其重懸于100 μLAnnexin V Binding Buffer中。將5 μL FITC Annexin V添加到細胞中，然后添加10 μL碘化丙啶（PI）。在室溫下孵育15 min后添加400 μL膜聯蛋白V結合緩沖液，通過FC500MCL流式細胞儀檢測細胞凋亡。（5）Jurkat細胞IL-21R蛋白表達水平測定：將RIPA裂解試劑添加到細胞沉淀中，在冰上裂解15 min后，提取蛋白質上清液。通過雙辛可寧酸（BCA）測定蛋白質量濃度后，在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）上電泳分離蛋白40 μg，電泳至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上（250 mA，100 min），在室溫下封閉放置60 min，并與一抗（IL-21R，β-肌動蛋白稀釋比例為1∶2,000、1∶1,500）在4℃下過夜。用磷酸鹽緩沖鹽水和Tween-20（PBST）洗滌3次后，加入HRP偶聯的二抗（1∶5,000，60 min），然后用PBST洗滌3次，加入化學發光溶液可視化蛋白質條帶。使用GS-900TM校準密度計定量密度，并使用ImageLab（BioRad）進行分析。

1.3 統計學分析 采用SPSS19.0統計軟件。計量資料以（）表示，兩組比較采用t檢驗，三組比較采用單因素方差分析，多重比較采用SNK-q檢驗，相關分析采用Pearson積差相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標比較 觀察組miR-155、IL-21R mRNA、IL-4、hs-CRP、TNF-α、CD44、Th21、IL-21 水平高于對照組（P＜0.05）。

表2 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標比較（）

表2 兩組miR-155、IL-21R mRNA及炎癥指標比較（）

注：與對照組比較，*P＜0.05

指標 對照組（n=102） 觀察組（n=110）miR-155mRNA 0.86±0.48 3.58±0.39*IL-21R mRNA 1.23±0.39 4.59±0.39*IL-4（pg/mL） 8.89±4.54 19.59±3.36*hs-CRP（μmol/L） 328.47±10.29 467.59±12.84*TNF-α（pg/mL） 4.59±2.48 39.85±5.48*CD44（%） 72.59±3.96 82.45±5.86*Th21（%） 2.30±0.58 3.96±0.39*IL-21（pg/mL） 5.54±2.69 16.96±3.55*

2.2 miR-155與各變量的相關性分析 miR-155與TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相關（r=0.458、0.563、0.489、0.539、0.636、0.574、0.669，P=0.004、0.001、0.030、0.020、0.003、0.007、0.010）。

2.3 各組Jurkat細胞OD值、存活率和凋亡率比較 與Jurkat組比較，miR-155 NC組OD值、存活率、凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與Jurkat組比較，miR-155 mimics組OD值、存活率升高，凋亡率降低，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低，凋亡率升高（P＜0.05）。見表3、圖1～2。

表3 各組Jurkat細胞OD值、存活率、凋亡率比較

圖1 各組Jurkat克隆形成數目比較

圖2 各組Jurkat細胞凋亡率比較

2.4 各組Jurkat細胞miR-155、IL-21R mRNA表達水平比較 與Jurkat組比較，miR-155 NC組miR-155、IL-21R mRNA和蛋白無明顯變化（P＞0.05）；與Jurkat組比較，miR-155 mimics組細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor組細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組Jurkat細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表達比較（）

表4 各組Jurkat細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白表達比較（）

注：與Jurkat組相比，*P＜0.05；與miR-155 mimics組比較，#P＜0.05

組別 復孔數 miR-155 mRNA IL-21R mRNA IL-21R蛋白（/GAPDH）Jurkat組 6 1.83±0.18 1.39±0.39 0.93±0.18 miR-155 NC 組 6 1.80±0.20 1.36±0.30 0.94±0.18 miR-155mimics組 6 3.92±0.20* 3.81±0.37* 1.28±0.17*miR-155inhibitor組 6 0.63±0.21*# 0.77±0.43*# 0.53±0.16*#

圖3 各組Jurkat細胞IL-21R蛋白比較

3 討論

AD是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，影響全世界約20%的兒童。該病表現出高度的病理生理異質性，導致相似的濕疹性皮膚病灶。皮膚組織中高水平表達的miR-155被鑒定為AD的組織標志物，這改善分子診斷。然而，當前診斷程序的侵入性、不便性限制其應用。因此，需要鑒定用于檢測AD的新型非侵入性生物標志物。最近，據報道在無細胞血漿中檢測到的miRNA可充當將患病個體與健康對照區分開的標記。由于血漿中miRNA的水平穩定，可重復在同一物種的個體中保持一致。血漿miRNA的非侵入性及其在疾病中的敏感性促使人們尋求更多的miRNA生物標志物。在血漿中已鑒定出約100種miRNA，這表明血漿miRNA包含多種疾病的信號，并可作為較多疾病的非侵入性診斷標記［10］。

MicroRNA（miRNA，miRs）是短的內源性非編碼RNA，通過翻譯抑制、mRNA失穩或這兩種機制的組合抑制蛋白質編碼基因的表達。miRNA在免疫穩態，淋巴譜系的發育和炎癥反應中起重要的調節作用。miRNA的差異表達已在幾種免疫和炎癥疾病中得到證實。MiR-155在多種免疫細胞譜系表達［11］（包括T淋巴細胞、B淋巴細胞、肥大細胞、成纖維細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞），其中一些與慢性皮膚炎癥的發病機制有關。有報道miR-155可以直接靶向促進IL-21R［12］。miRNA通過與帶有互補位點的靶mRNA的3'非翻譯區（UTR）結合而起作用。在人類中，根據生物信息學分析，IL-21R也是miR-155的靶基因，最近使用TaqMan低密度陣列（TLDA）研究表明，miR-155在AD病變中過表達，并主要在浸潤的免疫細胞中表達。本研究顯示，觀察組miR-155、IL-21R mRNA水平高于對照組，且miR-155與TNF-α、IL-4、IL-21、TH21、IL-21R mRNA、hs-CRP、CD44正相關（P＜0.05）。這與上述研究一致，同時也揭示miR-155、IL-21R在AD發病機制中具有重要調控作用。miR-155是AD皮膚中排名最高的miRNA之一（4.6倍上調）。研究表明，miR-155主要在浸潤的皮膚免疫細胞中表達，特別是在CD4+T輔助細胞和樹突狀細胞中表達。Th21細胞是最近鑒定出的CD4+T輔助細胞亞群，通過產生有效的細胞因子IL-21R，在自身免疫以及炎癥和過敏反應的發展中發揮關鍵作用［13-14］，這些報道均與本研究結果一致。

本研究結果表明，與Jurkat組比較，miR-155 mimics組OD值、存活率升高、細胞凋亡率降低，miR-155 inhibitor組OD值、存活率降低、細胞凋亡率升高；與miR-155mimics組比較，miR-155inhibitor組OD值、存活率降低、細胞凋亡率升高（P＜0.05），表明，miR-155能明顯促進炎癥細胞Jurkat增殖、抑制其凋亡。miR-155明顯增加培養的CD4+T細胞中Th21細胞的百分比，并促進IL-21R的mRNA表達，以及無細胞上清液中IL-21R的蛋白濃度［15-16］。IL-21R是Janus激酶/信號轉導子和轉錄激活子（JAK/STAT）信號通路的負調節劑，可調節T淋巴細胞的激活、發育和分化，并參與免疫和炎癥性疾病。最近，通過表征IL-21R的模擬物，明確IL-21R對Th21細胞分化和功能的影響，IL-21R可促進IL-6誘導的STAT3活化并激活Th21細胞的發育［17-18］。本研究顯示，與Jurkat組比較，miR-155 mimics組細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白升高，miR-155 inhibitor組細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低；與miR-155 mimics組比較，miR-155 inhibitor組單細胞miR-155、IL-21R mRNA和蛋白降低（P＜0.05），這與前述討論一致。同時也表明在炎癥細胞Jurkat中，miR-155可能通過促進IL-21R的表達進而參與AD的發病機制。

綜上所述，AD患者miR-155、IL-21R表達水平升高，miR-155可能通過促進IL-21R的表達進而參與AD的發病。