先天性巨大黑素痣的發病機制及其靶向治療的研究進展

王嘉廳 綜述，吳信峰 審校

（中國醫學科學院皮膚病醫院整形美容外科 江蘇 南京 210042）

先天性巨大黑素痣（GCMN）是一種神經嵴起源的皮膚黑素細胞良性增生，不僅嚴重影響患者外觀，給患者造成極大的心理壓力，而且相關研究證實GCMN患者會有一定幾率并發神經皮膚黑變病（Neurocutaneous melanosis,NCM）和惡性黑素瘤（Malignant melanoma,MM）。目前，對于GCMN的病因及發病機制尚不明了，對GCMN的治療亦尚無滿意的方法。非手術治療主要有化學剝脫、激光等，雖然能夠改善局部外觀，但并不能完全清除真皮深層及皮下組織的痣細胞，因此仍然存在復發甚至惡變的可能性；手術治療是主要的治療方法，但是手術治療的效果往往不盡如人意，而且治療周期長，并發癥多，影響患者的生活質量。本文從分子生物學的角度，主要針對GCMN的發病機制及其靶向治療進行闡述，來探討靶向治療GCMN的效果。

1 GCMN的發病機制

目前，GCMN的病因及發病機制尚不明了，從分子生物學的角度研究，發現多種基因突變及明星信號通路的激活對GCMN的形成和發展至關重要。

1.1 RAS/ERK信號通路：RAS基因是一種在生物進化過程中高度保守的原癌基因，其與細胞增殖、分化、凋亡及遷移密切相關。通過合子后基因突變激活特定的信號通路已被證明與皮膚良惡性腫瘤的發生有關。通常，這些突變構成激活RAS家族GTP酶蛋白的一個亞型，即HRAS、NRAS或KRAS，并涉及第12、13和61密碼子的熱點突變[1]。這些RAS蛋白具有GTP/GDP結合和GTP酶活性，RAS基因突變導致RAS蛋白自身的GTP酶活性下降，使得RAS-GTP不能變成RAS-GDP而始終處于與GTP結合的狀態，造成RAS-RAF-MEK-ERK通路過度激活，從而導致細胞的過度增殖與腫瘤的發生。

幾乎所有的GCMN都是偶發的，認為GCMN是由偶發的合子后體細胞突變所致，同卵雙生子的不一致性和病變的節段性分布也證明了這一點，但也有家族聚集性的報道[2]。對GCMN突變基因的研究大部分集中在NRAS和BRAF，其中體細胞NRAS突變（p.Q61K，p.Q61R）發生在50%～95%的患者中，而BRAF突變（V600E）頻率為0%～40%[1,3-8]。其中，Charbel等[3]使用了各種敏感的檢測方法研究GCMN，發現94.7%(18/19)的GCMN存在NRAS突變，并進一步使用全外顯子測序對5個樣本進行了評估，發現NRAS突變很可能是啟動事件，因為沒有發現其他突變具有更高的突變頻率。但Stark等[6]認為，考慮到突變等位基因頻率(Mutant allele frequency,MAF)，如果GCMN是由合子后NRAS突變引發和驅動的，則相應的MAF應該相對較高（MAF≥10%）。綜上，鑒于GCMN中存在極高頻率的NRAS或BRAF突變，可推測RASRAF-MEK-ERK信號通路中癌基因的激活突變似乎是GCMN形成的先決條件。此外，若相應的MAF較高則更能證實這一點。

GCMN中的NRAS和BRAF突變總是互斥的，即兩種突變不共存于同一皮損中[1,3,5,7-8]。這表明它們可能在相同的RAS/ERK信號通路上發揮作用。在臨床特征方面，NRAS突變的GCMN表現為體積更大、部位多發等，說明NRAS突變比BRAF突變的GCMN具有更強的生長信號，因為激活的NRAS可通過ERK和PI3K/AKT通路進行信號傳導，而激活的BRAF只通過ERK信號傳導[1,9]。除了促進細胞增殖，激活PI3K/AKT還通過刺激Rac1促進黑素細胞存活和定向遷移[10]。此外，NRAS突變同時激活這兩種通路的能力可能導致NCM的預后相對較差；NRAS突變的GCMN表現出更大面積及多部位發病等特征也可能與延遲的癌基因誘導衰老（Oncogene-induced senescence,OIS）相關[1]。相關研究表明，NRAS突變的CMN都表達干細胞或祖細胞表型，如：Sox10、Nestin、Oct4等，并且這些CMN體積越大，增殖、克隆能力越強，惡性轉化風險越高[11-12]。若GCMN表現為體積巨大，有多發的衛星痣病變等，則更傾向于存在NRAS突變，其惡性程度更高，預后相對較差，需進行早期干預以及長期隨訪。

1.2 Wnt/β-catenin信號通路：經典Wnt/β-catenin信號在胚胎發育和成人組織穩態中發揮著關鍵作用。Wnt是一類分泌型糖蛋白，通過自分泌或旁分泌發揮作用，接收Wnt信號的是跨膜受體FZD蛋白家族，隨后通過下游蛋白激酶的磷酸化作用影響β-catenin的降解。當Wnt激活時，β-catenin的降解活性受到抑制，胞漿中穩定積累的β-catenin進入細胞核后結合LEF/TCF轉錄因子家族，啟動下游靶基因（如c-myc、Cyclin D1等）的轉錄，其異常表達或激活能引起腫瘤[13]。

Kinsler等[11]研究表明，CMN同時表達細胞核和細胞質定位的β-catenin。Pawlikowski等[14]研究GCMN發現病變的黑素細胞巢顯示出細胞核β-catenin及其促增殖靶點Cyclin D1和c-myc的一致表達，而正常表皮黑素細胞則不表達。同時，在小鼠模型中發現激活Wnt信號可以延緩或繞過黑素細胞的衰老，從而促進痣的形成；之后，持續激活的Wnt信號可能會破壞衰老介導的腫瘤抑制，增加惡性轉化的風險。上述研究提示激活的Wnt信號與GCMN的形成相關，也可能參與GCMN惡性轉化的過程。

此外，在轉基因小鼠模型中，激活的Wnt信號促進了NRAS（p.Q61K）突變誘導的S100陽性黑素細胞增殖和皮膚黑化（S100B蛋白在大部分GCMN中高表達[15]），激活的Wnt信號可能與激活的NRAS在GCMN的發病機制中具有協同作用[14,16]。這說明Wnt/β-catenin通路和RAS/MEK通路中的明星分子在促進GCMN的形成過程中存在交互作用，但仍需要更多的研究來明確兩者在GCMN發病機制中復雜的分子網絡調控關系以及直接或間接的調控模式等。

1.3 Shh信號通路：Hedgehog (Hh)通路在成人組織維持、更新和再生過程中起到關鍵作用。Hh配體蛋白包括Shh、Ihh和Dhh蛋白；Hh信號傳遞受靶細胞膜上兩種受體Ptc和Smo的控制，具有反饋調節機制；Hh通路的轉錄因子是Gli蛋白家族。正常情況下，Smo正向激活轉錄因子，但Ptc受體能抑制Smo蛋白活性，抑制下游通路，實現自我調節。異常活化的Hh信號轉導會引發多種惡性腫瘤，包括典型的基底細胞癌和髓母細胞瘤等[17]。

Chitsazan等[18]研究發現，在NRAS突變的背景下，促進CMN發展的最佳候選基因是Cdon，它是一種主要在角質形成細胞中表達的Shh信號通路的正調節因子。Chitsazan等[19]進一步研究發現，在攜帶黑素細胞NRAS第61密碼子突變的小鼠模型中，角質形成細胞Shh通路活性增加；通過角質形成細胞釋放內皮素-1(Endothelin-1,Edn-1)，該模型能發展出巨大的先天性痣，并通過rescue實驗驗證了這一點，即使用Shh和內皮素拮抗劑抑制了小鼠的痣發育。這與Charbel等研究的結果一致，某些CMN細胞亞型仍表現出諸如克隆形成的潛能等特征，并在與相鄰角質形成細胞協同作用時擴展成痣樣結構，這可以解釋痣的二次復發，以及痣在兒童成長過程中的自然擴張[20]。角質形成細胞Shh- Edn-1旁分泌信號也可能促進GCMN的發生，同時，從角質形成細胞的旁分泌信號通路出發，也為GCMN的靶向治療研究提供了一個新的方向。

1.4 cAMP信號通路：MC1R是一個高度多態的基因，它與色素和非色素（DNA修復）的功能相關，是在黑素細胞中生成黑色素的關鍵控制器。當α-MSH刺激MC1R時，它通過腺苷酸環化酶（AC）激活產生cAMP；cAMP進而激活PKA，PKA通過CREB的磷酸化激活MITF的基因表達；最后通過酪氨酸酶（TYR）和Tyr相關蛋白（TYRP1和DCT）的上調，將褐黑素轉換為真黑素的合成[21]。已知MC1R的變異與黑素瘤、基底細胞癌、鱗癌等皮膚腫瘤的發生密切相關。

Kinsler等[22]報道了英國GCMN家族中紅發和雀斑患者的高患病率,并研究與胚胎系MC1R基因型的關聯。在這項GCMN的研究中，發現V92M或R等位基因(D84E, R151C, R160W,D294H)的存在與較大的GCMN和出生體重顯著相關，提示這些等位基因具有促進生長的作用。研究表明MC1R基因中胚胎系變異的存在可能調節GCMN的大小。與之相反，Calbet-Llopart等[23]研究分析MC1R變異對來自歐洲和北美不同國家的中-巨型CMN患者表型屬性的影響，發現p.V92M變異或任何“R”等位基因的存在，無論是單獨或聯合，都與GCMN的成年后預測大小（Projected adult size,PAS）無關，表明MC1R基因型變異與GCMN的大小無關。然而，不能排除MC1R變異作為GCMN發展的危險因素，特別是在兩個等位基因上都有MC1R變異的攜帶者中，還需要進一步的研究來闡明MC1R基因在GCMN發展中的作用以及是否與種族背景相關。

1.5 其他：除上述典型的基因突變和信號傳導通路異常之外，GCMN也可能由其他不同的分子事件導致，包括其他基因的點突變和融合轉錄等。

Silva等[5]對21例GCMN患者（12例為經典型GCMN，9例為溢出型GCMN）病變部位進行多基因面板和RNA測序分析，結果顯示2例無NRAS突變的經典型GCMN患者中存在ZEB2-ALK和SOX5-RAF1融合轉錄，而在溢出型GCMN患者中發現存在KRAS、APC和MET等基因突變。Stark等[24]則在野生型NRAS的GCMN中發現了另一些潛在的基因驅動突變，包括LFNG、TMEM2和MMR基因，代表了GCMN發展的替代機制。此外，還有學者報道了GCMN病變的皮損中同時存在胚胎系突變和體細胞突變[25-26]。可見，GCMN的基因型也存在較大的異質性，這或許是GCMN作為良性腫瘤的特點之一，由于腫瘤的惡性進展是多階段的和基因突變累積的過程，上述基因在GCMN發展和惡變中的作用有待進一步研究。

2 GCMN的靶向治療

針對上述發病機制，靶向這些基因突變以及異常的信號通路可能是GCMN的一種潛在治療策略，國內外多位學者做了許多相關的研究。

2.1 生物信息學分析：Wei等[27]首次對GCMN進行了全面的轉錄組分析，利用生物信息學手段揭示了GCMN中p16誘導的細胞周期停滯，抗凋亡性和腫瘤抗原處理功能失常引起的免疫逃避；主要組織相容性復合體（MHC）I類介導的腫瘤抗原處理是GCMN中明顯下調的關鍵途徑，ITCH、FBXW7、HECW2和WWP1被確定為候選的樞紐基因。生信分析能夠在一定程度上指導基礎科研的實驗設計等，上述的研究發現也為GCMN的靶向和免疫治療提供了新的視角。

2.2 細胞實驗：Qingxiong等[28]在GCMN中分離出原代痣細胞(GNCs)，應用vemurafenib和trametinib處理顯著降低了GNCs的增殖并促進其凋亡，同時發現ERK信號的激活也被顯著抑制并增加了GNCs中p53蛋白的表達。Basu等[29]用NRAS信號通路的特異性抑制劑(Vemurafenib, MEK162, GDC0941以及GSK2126458)處理來自4例NCM患者的脊髓、大腦和皮膚的病變細胞，發現這些抑制劑能夠降低NRAS突變細胞的活力。Rouillé等[30]使用MEK和Akt抑制劑降低了成球試驗中的痣球直徑，并抑制了痣細胞的活力和增殖；然后用相同的抑制劑體外培養標準化的GCMN外植體，這導致表皮和真皮中的MelanA+和Sox10+痣細胞數量減少，并且不影響正常皮膚的黑素細胞。綜上，體外細胞實驗明確了靶向RAS/ERK通路治療GCMN的可行性，靶向藥物可以抑制病變細胞的活力和增殖、促進凋亡，但仍需要進一步研究這些抑制劑的細胞毒性等。

2.3 動物實驗：在動物模型水平上，也有許多相關研究驗證了靶向藥物對GCMN形成和發展的影響。Pawlikowski等[16]利用NRAS和Wnt信號均激活的小鼠建立了CMN綜合征的動物模型，并在小鼠出生后使用MEK抑制劑selumetinib治療，可以很大程度上緩解這種小鼠模型中CMN綜合征的皮膚、大腦和軟腦膜中黑素細胞的大量擴張。Rouillé等[30]在免疫損害的Rag2-/-小鼠背上進行全厚的GCMN異種移植，然后使用MEK和Akt抑制劑皮內注射在這些異種移植物中，抑制劑能誘導痣細胞的急劇減少，并且這種效應在治療結束后30 d仍持續存在，且兩種抑制劑合用時治療效果更加明顯。同時，這種GCMN患者來源的異種模型的建立，能夠在更符合人體本身環境的條件下為GCMN尋找新的治療手段[31]。Shakhova等[32]建立了一個顯著表達Sox10的GCMN小鼠模型，研究發現Sox10單倍不足可以抵消NRAS突變驅動的GCMN的形成，而不影響皮膚神經嵴衍生物的生理功能。此外，Chitsazan等[19]使用Shh和內皮素途徑拮抗劑(分別為LDE225和Bosentan)靶向Cdon-Shh-Edn-1軸可抑制GCMN小鼠模型痣的形成，導致相關的黑素細胞增多癥的消失。動物模型的建立和體內動物實驗為研究GCMN的靶向治療提供了更高等級的證據和可信度，就目前來看，考慮到與疾病的相似性，筆者認為GCMN患者來源的異種移植模型是一種較優的選擇；同時也可積極尋找相應的自發性疾病動物模型，有利于排除干擾因素。

2.4 臨床試驗性治療：Küsters-Vandevelde等[33]報告了1例患有NRAS突變的CMN和NCM的13歲男孩，在手術治療不理想后，使用MEK162治療，觀察到與治療前相比，治療后病變樣本中MIB-1和p-ERK蛋白水平表達降低，提示MEK抑制治療的潛在影響。Mir等[34]報道了1例患有GCMN（AKAP9-BRAF融合基因驅動）的7歲女孩，在經過trametinib治療后，頑固性疼痛和瘙癢癥狀迅速緩解，皮損的大小、質地和厚度也有了顯著的改善。還有數據表明，這種BRAF融合基因激活的改變可能賦予MEK抑制的敏感性[35]。可見，雖然試驗性的靶向GCMN治療能在一定程度上緩解患者的癥狀，但屬于極少數的個案報道，缺乏大規模的臨床前試驗和臨床研究。

3 小結和展望

近年來，多種基因突變和信號傳導通路的異常激活與GCMN發病機制的關系得到越來越多的研究證實，雖然根據目前相關的基礎研究及臨床資料尚不足以明確其發病機制，但對研究GCMN的靶向藥物治療有著良好的啟示作用。針對GCMN的發病機制，由于其基因型和表型均存在較大的個體異質性，可進行全基因組關聯分析（Genome wide association study,GWAS）來研究基因型與表型之間的關聯或在大病例對照隊列中進行遺傳學研究等；針對GCMN的靶向藥物治療，隨著高通量測序及芯片技術的發展，通過數據挖掘尋找候選的生物標記和潛在的治療靶點，并通過體外細胞實驗，建立動物模型（如異種移植）、臨床實驗來驗證靶向治療能否作為GCMN的輔助療法，以避免重復的手術。值得注意的是，GCMN相比于MM涉及突變相對較少，靶向治療耐藥的幾率或者會降低；局部皮內給藥治療皮損或穿過血腦屏障的系統給藥治療NCM能否降低其惡性轉化風險等也仍需要更加廣泛和深入的研究。隨著精準醫療（Precision medicine）的理念趨于實踐，靶向藥物的治療將有著良好的應用前景。