紫芽六堡茶轉錄組SSR位點序列分析

梁燕妮， 黃銀霞， 魏詩琴， 陳秋雨

(梧州學院，廣西梧州 543002)

六堡茶因其原產于廣西壯族自治區梧州蒼梧縣六堡鎮而得名，為廣西特色優質的歷史名茶，并以其“紅、濃、陳、醇”的特性聞名于世。六堡茶的制作以六堡鎮的群體種茶樹為原料，六堡群體種茶樹為灌木型中小葉種，樹勢開展，分枝密。從芽色分，以青苗茶為主，占60%，紫芽茶占20%，茶樹紅紫色芽葉是一種特異茶葉資源，紫芽六堡茶樹由于富含花青素成為當前茶樹新品種開發利用的熱點及研究的重點。

簡單重復序列(simple sequence repeat，簡稱SSR)別稱微衛星DNA，以1～6個堿基為核心序列，具有多態性高、重復性好、穩定性高等特點，隨著現代分子技術的發展，SSR技術已廣泛應用于植物分子輔助育種、種質資源遺傳多樣性、繪制遺傳圖譜等方面的研究中。毛娟等利用30對茶樹核心SSR引物，對3個代表性的野生和栽培大理茶居群進行遺傳分析。陳春林等從紫娟茶樹轉錄組 46 041 條單基因簇(unigene)中篩選出57 976個SSR位點，并對SSR序列的分布特征進行了分析，篩選出44對高質量引物。班秋艷等對陜西及臨近8個省份118份茶樹資源利用表達序列標簽(EST)-SSR分子標記進行了遺傳多樣性分析。但目前尚未見針對紫芽六堡茶SSR位點的分析報告。本研究基于轉錄組測序，首次對紫芽六堡茶轉錄組SSR位點的分布及其序列特征進行分析，以期為今后紫芽六堡茶品種選育、功能基因標記等提供基礎依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

所用鮮茶葉于2021年6月采自廣西壯族自治區梧州六堡鎮四柳村群體種六堡茶。分別采摘1芽1葉的紫芽、綠芽六堡茶葉片，用離心管裝好，迅速放入液氮中保存。每個樣品3次重復。將采集的樣品委托深圳華大基因股份有限公司進行轉錄組測序。

1.2 SSR位點搜索

針對Raw數據，本試驗采用SOAPnuke軟件進行數據的過濾與質控，將包含接頭污染的讀長(reads)、未知堿基N含量大于5%的reads以及質量值低于10的堿基含量大于20%的reads去除，以獲得高質量序列。使用Trinity對干凈讀序(clean reads)進行組裝，然后使用Tgicl對轉錄本進行聚類去冗余得到unigene。使用MISA( http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa)對獲得的unigene進行SSR位點搜索，搜索標準為單堿基重復次數12次以上，雙堿基重復次數6次以上，三堿基和四堿基重復次數5次以上，五堿基和六堿基重復次數4次以上；2個SSR之間的間隔堿基數>100 bp，SSR位點距離兩端側翼序列>150 bp。使用Primer 3 對檢測到的SSR進行引物設計。

1.3 數據分析

所得數據使用Excel軟件進行處理分析，包括SSR位點的出現頻率、基元類型、基元組成、平均距離等。其中，SSR位點出現頻率是搜索到的SSR總數與unigene序列總數的比值；SSR位點的平均距離是搜索到的SSR總數與總unigene長度之比，根據這些數據所反映出的特征可以對SSR 位點的分布特征和序列特征進行分析。

2 結果與分析

2.1 紫芽六堡茶轉錄組中SSR 位點的分布特征

通過對紫芽六堡茶葉片進行轉錄組測序，共獲得去冗余的unigene序列 165 570 條，總長度為 240 177 233 bp，其中G+C占41.49%。利用軟件SSRFinder對這些序列數據進行搜索，共在10 058 條unigene中找到符合條件的SSR，總長為 238 833 bp，SSR位點發生的頻率為6.04%，其中，8 867 條unigene含單個SSR位點，1 191條unigene 序列含有1個以上的SSR位點。共檢出 11 482 個SSR位點，出現的頻率為6.93%。SSR分布的平均距離為 20.92 kb，即平均每 20.92 kb就出現1個SSR(表1)。

表1 轉錄組各SSR位點的分布特征

2.2 紫芽六堡茶轉錄組SSR的基元類型

紫芽六堡茶轉錄組中具有較為豐富的SSR堿基類型(表2)。其中重復率最高的為雙堿基，占SSR位點總數的55.01%，其次為三堿基、六堿基，分別占28.64%、8.22%，其他的重復堿基類型所占比例較低(圖1)。各重復堿基類型的出現頻率存在一定差異。主要集中在雙堿基和三堿基重復上，占總SSR的83.65%。其中，雙堿基重復類型出現頻率最高，為3.81%，出現頻率最低的是單堿基重復，僅為0.11%。從分布情況看，轉錄組中平均每20.92 kb就出現1個SSR，不同重復類型間平均分布距離存在差別。其中，單堿基重復的平均分布距離最長，為1 264.09 kb；其次是四堿基重復，平均分布距離為839.78 kb；雙堿基重復的平均距離最短，為38.03 kb。紫芽六堡茶轉錄組SSR位點的序列總長度為238 833 bp，平均長度為20.80 bp。

表2 紫芽六堡茶轉錄組SSR位點不同基元類型的分布狀況

2.3 紫芽六堡茶轉錄組SSR重復基元分析

紫芽六堡茶轉錄組SSR重復基元的序列特征詳見表3。由單堿基到六堿基重復基元種類數分別為 2、6、30、48、121、460 種，共667種。各堿基重復基元的數量分布不均衡，其中，單堿基重復基元數量最多的是 A/T，共186個，占SSR總位點數的1.62%，占單堿基重復基元總數的97.89%。雙堿基重復基元中，數量最多的類型是GA/TC，共 2 185 個，占SSR總位點數的19.03%，占雙堿基重復基元總數的35.45%；其次是AG/CT，共2 165個，占SSR總位點數的18.86%，占雙堿基重復基元總數的34.28%。三堿基重復基元中，數量最多的類型是GAA/TTC，共345個，占SSR總位點數的3.00%，占三堿基重復基元總數的10.49%；其次是AGA/TCT，共288個，占SSR總位點數的2.51%，占三堿基重復基元總數的8.76%。四堿基重復基元中，數量最多的類型是AAAT/ATTT，共55個，占SSR總位點數的0.48%，占四堿基重復基元總數的19.23%。

表3 SSR 位點重復的基元序列特征

五堿基重復基元中，數量最多的類型是AAAAG/CTTTT，共48個，占SSR總位點數的0.42%，占五堿基重復基元總數的10.50%。六堿基重復基元中，數量最多的類型分別是AAAAAT/ATTTTT、CAAAAA/TTTTTG、GATGAA/TTCATC，各有22個，各占SSR總位點數的0.19%，各占六堿基重復基元總數的2.33%。轉錄組中不同SSR重復基元類型的比例詳見圖2。

2.4 紫芽六堡茶轉錄組中各基元的重復次數

SSR的多態性受重復堿基序列長度的影響，而重復堿基序列長度由SSR重復次數決定。通過對紫芽六堡茶轉錄組中不同基元類型SSR位點重復出現次數的統計(表4)可知，6種基元重復次數主要集中在4～12次，重復出現4～12次的SSR位點數共計9 941個，占總SSR位點數的86.58%。其中，重復出現6次和5次的SSR位點數最多，分別占總SSR位點數的16.63%(1 910個)、15.89%(1 825個)；其次為重復7次和8次的，分別占總SSR位點數的10.53%(1 209個)、9.80%(1 125個)。統計發現，在重復出現6次的SSR位點中，雙堿基最多(1 062個)，其次是三堿基(673個)，五堿基最少(僅20個)。重復出現5次的SSR位點中，三堿基最多(1 375個)，四堿基、五堿基、六堿基的數量差別不大。SSR位點重復次數在12次以上的基元占總SSR位點數的13.42%。不同基元類型不同重復次數的SSR位點數分布情況見圖3。從圖3可以看出，隨著重復次數的增多，SSR位點的數量逐漸下降。

表4 不同基元類型不同重復次數的SSR 位點數量

2.5 紫芽六堡茶轉錄組SSR重復片段的長度分布

紫芽六堡茶轉錄組SSR重復片段的長度分布情況見圖4。SSR序列長度變化在12～70 bp之間，平均長度為20.80 bp。其中長度為24 bp的SSR位點數最多，共有1 838個，占SSR總數的16.01%。長度在12～20 bp的SSR有6 424個，占SSR總數的55.95%；>20 bp的SSR有5 058個，占SSR總數的44.05%。雙堿基中最常見的長度是12 bp(1 021個，9.24%)，長度變化幅度最大，最小為 12 bp 最長為70 bp。三堿基中最多的長度為15 bp(1 375個，11.98%)。四堿基、五堿基均以20 bp為主，分別有186(1.62%)、307(2.67%)個。六堿基中長度以24 bp(668個，5.82%)數量最多。

3 討論與結論

通過對紫芽六堡茶進行轉錄組測序，共獲得165 570 條unigene序列，總長度為240 177 233 bp，共搜索到11 482個SSR位點，出現頻率為6.93%，略低于楊華等報道的茶樹轉錄組中SSR位點出現頻率(9.64%)，但高于南方紅豆杉(2.07%)、杜仲(2.90%)、短絲木樨(4.64%)、銀杏(5.95%)、馬尾松(3.45%)、云南松(3.07%)、甘薯(4.4%)等植物。紫芽六堡茶轉錄組SSR分布的平均距離為20.92 kb，分布水平高于云南松(29.00 kb)、杜仲(26.31 kb)、藤茶(31.69 kb)等植物。與其他已報道的茶樹比較(表5)可知，紫芽六堡茶的SSR位點出現頻率和平均距離與其他茶樹存在較大差異，這可能與本研究中搜索SSR的算法不一致、數據處理方法不同、以及進化程度不同等因素有關?？傮w來說，紫芽六堡茶轉錄組中SSR位點的種類和數量還是較為豐富的，可為今后分子育種提供依據。

表5 不同茶樹品種SSR位點信息比較

大多數研究表明，植物SSR重復基元以雙堿基與三堿基重復為主。本研究發現紫芽六堡茶轉錄組SSR重復基元以雙堿基重復最多，占SSR位點總數的55.01%，其次為三堿基重復，占SSR位點總數的28.64%，這與陳春林等報道的茶樹SSR優勢重復類型一致。銀杏、獼猴桃、杏樹和桃樹等植物也是以雙堿基重復為主。而玉米、水稻、小麥等禾谷類作物則以三堿基重復為主。經統計，紫芽六堡茶單堿基的優勢重復基元為A/T，與已報道的大多茶樹單堿基優勢重復基元一致；雙堿基的優勢重復基元為GA/TC，而已報道的茶樹中則多以AG/CT為主；三堿基的優勢重復基元為GAA/TTC，與龍井43一致；四堿基的優勢重復基元為AAAT/ATTT，與龍井43、舒茶早、云抗10號、紫鵑等茶樹一致；五堿基的優勢重復基元為AAAAT/ATTTT，與舒茶早、云抗10號一致；六堿基的優勢重復基元為AAAAAT/ATTTTT，與云抗10號一致(表6)。表明基于轉錄組測序得到的SSR位點中可能普遍大量存在這類重復基元，推測可能是某些特定的DNA家族或者輔助合成某些優勢蛋白。此外，在搜索到的紫芽六堡茶SSR位點中還發現了在高等植物轉錄組中較為少見的CG/GC 重復基元11個，以及在雙子葉植物中不常見的CCG/CGG重復基元45個，這些位點可能與一些特定的生理功能，如抗逆性、信號傳導、代謝調控等有關，表明紫芽六堡茶的SSR位點具有一定的特異性。

表6 不同茶樹品種SSR位點重復基元序列最多的堿基組成

有研究認為，SSR的多態性與SSR基元重復次數及序列長度密切相關。一般認為重復次數越多，長度越長，多態性越高，當重復次數>12次時，多態位點含量高，紫芽六堡茶基元重復次數在12次以上的占13.42%。當SSR長度在12～20 bp之間時，多態性表現一般；當SSR長度>20 bp時，則具有較高的多態性。紫芽六堡茶轉錄組的SSR平均長度為20.80 bp，其中序列長度>20 bp的占44.05%，高于四球茶(33.22%)、龍井43(19.77%)以及舒茶早(8.65%)。表明紫芽六堡茶轉錄組SSR具有很高多態性和利用價值。

綜上所述，本研究結果表明，紫芽六堡茶的SSR種類豐富、可用性高、多態性高?？蔀檫M一步開發紫芽六堡茶功能基因SSR分子標記奠定基礎，對六堡茶種質資源的保護及茶樹特定性狀的輔助選育、基因組學的研究等方面都具有重要的意義。