基于組織結構特征和蛋白質與鈣含量比值的鹿茸分區研究

趙海平，姚夢杰，徐 源，劉 佳，岳志剛，齊曉妍，李春義

基于組織結構特征和蛋白質與鈣含量比值的鹿茸分區研究

趙海平1, 3，姚夢杰1，徐 源1，劉 佳1，岳志剛1，齊曉妍1，李春義2*

1.中國農業科學院特產研究所吉林省鹿茸工程研究中心，吉林 長春 130112 2.鹿茸科學與產品技術研究所長春科技學院，吉林 長春 130600 3.青島農業大學動物科技學院，山東 青島 266109

建立客觀鹿茸分區方法。采集3種規格的鹿茸，分別為馬鹿三杈茸、梅花鹿三杈茸和二杠茸。通過縱向剖面、橫斷面和組織學切片對鹿茸內部組織結構、形態特征和組織類型進行分析，確定鹿茸的感官分區指標。通過測定鹿茸不同區段成分上的差異，設立數據化的分區指標。建立血管形態和骨密質環2個感官分區指標，蠟片：無肉眼可見血管；粉片：血管細密，粗細均勻；蜂片：開始出現密質骨時，周圍血管細密，中間粗，呈蜂窩狀；骨片：密質骨連成骨密質環。利用蛋白質含量和鈣含量的比值設定了不同區段鹿茸分區值（PV值）：蠟片≥65.00，粉片6.30～64.99，蜂片4.70～6.29，骨片≤4.69。通過感官指標和PV值建立了鹿茸的客觀分區方法，能夠精確客觀地對鹿茸進行分區，不僅適用于不同種鹿茸，如馬鹿茸和梅花鹿茸；而且也適用于不同規格的鹿茸，如二杠茸和三杈茸；還能夠適用于不同加工方式處理的鹿茸，如傳統煮炸法和冷凍真空干燥法。該方法為增強鹿茸治療的針對性和促進鹿茸深加工奠定了基礎。

鹿茸；內部組織特點；馬鹿三杈茸；梅花鹿三杈茸；二杠茸；分區值

鹿茸是鹿科動物梅花鹿Temminck或馬鹿Linnaeus的雄性未骨化密生茸毛的幼角，為雄鹿的第二性征。鹿茸作為我國的傳統中藥，最早記載于《神農本草經》。根據《中國藥典》2020年版，鹿茸具有壯腎陽、益精血、強筋骨、調沖任、托瘡毒的功效[1]。由于鹿茸的組織成分從上到下并非勻質，所以不同部位的藥效各有不同。同一鹿種不同區段的鹿茸價格迥異，自尖部到基部逐漸降低，尖部價格為基部價格的上百倍[2]。這種巨大的價格差距說明，在我國近2000年對鹿茸的應用歷史過程中，人們已經發現同一鹿種不同區段鹿茸之間的功效有著很大的差異。

鹿茸作為自然界唯一能夠完全再生的[3]、組織生長速度最快（達2.75 cm/d）[4]和骨化速度最快（平均高達250 g/d）[5-7]最快的哺乳動物器官，在近代成為組織器官發育[8]、再生[3]、軟骨和皮膚缺損修復[9]等方面的獨特研究模型。研究發現鹿茸的生長中心位于尖部，該部除皮膚外由既連續又可獨立區分的4個組織層構成：間充質層、前軟骨層、過度層和軟骨層；不同組織層的細胞種類、組織類型均不相同[10]。現代生物學研究也證明同一鹿種不同區段鹿茸的功效也有顯著差別[11]。

雖然在傳統應用和現代生物學均已發現鹿茸不同部位的差異，但由于沒有科學的、精確的、客觀的標準，鹿茸的分區只能憑主觀判斷進行操作。所以目前鹿茸的分區比較混亂，方法不一，而且不同文獻中對鹿茸同一個區段的稱謂也不一致。從業者常采用多區段的分法，如蠟片、半蠟片、白粉片、黃粉片、紅粉片、蜂片、骨片等。與之不同的是，學術上常采用4區段分法，如蠟片、粉片、蜂片、骨片[2]。除此，還有多種不同的稱謂，如張嵩等[12]將鹿茸的4個區段稱為蠟片、粉片、紗片、骨片；王艷梅等[13]將鹿茸的4個區段稱為蠟片、粉片、血片和骨片；而汪樹理等[14]、郭月秋等[15]將其稱為蠟片、粉片、紗片和骨片；還有人將其稱為嘴片、粉片、紗片骨片[16]。坊間還有血片（蠟片）、粉片和老角片之說。國內也有人在分析鹿茸成分時采用西方的3區段分法：上部、中部、下部[17]。按照現行《中華人民共和國農業行業標準》（NY/T1162-2006鹿茸片）（2006年頒布，以下統一簡稱為“行業標準”），鹿茸自尖部到基部分為蠟片、粉片、紗片、骨片4個區段。“行業標準”中對鹿茸的分區主要是根據傳統經驗通過感觀對色澤、組織形態、氣味等方面進行人工主觀識別，缺乏明確的客觀指標，本研究中稱之為“傳統鹿茸分區方法”。由于傳統鹿茸分區方法不能科學地、精確地、客觀地區分鹿茸的不同區段，限制了臨床上不同區段鹿茸對不同疾病的針對性治療，致使鹿茸的功效沒有得到合理的利用；也阻礙了鹿茸質量標準的制定和深加工產品的研發。本課題組認為，建立科學的、精確的客觀鹿茸分區方法，是使鹿茸這味傳統中藥走向現代化發展道路的先決條件。

本研究結合行業標準與傳統稱謂，將鹿茸這4個區段分別稱為蠟片、粉片（血片）、蜂片（紗片）、骨片；并依據鹿茸的外部形態，內部組織結構特點和成分組成建立了客觀鹿茸分區方法，為使鹿茸的藥效得到科學合理地應用，促進鹿茸這一傳統中藥走向現代化的發展道路奠定了基礎。

1 儀器與材料

RM2255型石蠟切片機，德國萊卡公司；e2695型液相色譜，美國Waters公司；凱氏定氮儀，美國Tecator公司；MARS5型密閉微波消解儀，美國CEM公司；7700X型電感耦合等離子體質譜（ICP-MS），美國安捷倫公司；FDU-1100型冷凍干燥機，東京理化EYELA公司；DQ-100型手動參茸切片機，大德藥機有限公司；FW135型中藥粉碎機，天津泰斯特儀器公司。

2 方法

2.1 鹿茸樣品處理

采集能夠反映不同種類（包含馬鹿和梅花鹿）和不同發育時期（三杈茸和二杠茸）鹿茸，其中鮮茸（鋸茸后立即帶回實驗室，進行后續處理）和干茸（按照傳統煮炸加工方法干制，非排血茸）各3支（表1），包括馬鹿三杈茸（圖1-A、D）和梅花鹿三杈茸（圖1-B、E）、二杠茸（圖1-C、F）各6支。用于觀察內部組織結構和測定成分。另采集1支梅花鹿三杈鮮茸，用于組織學分析。所有鹿茸均采集自中國農業科學院特產研究所試驗站，均具有種屬特異性的典型特征。

2.2 鹿茸內部組織結構觀察和分區

將1支梅花鹿三杈鮮茸鋸成約20 cm的小段（圖2），沿正中縱向剖開。一側用于肉眼觀察不同區段的組織結構，找出有標志性的形態特點；另一側沿縱向每隔一段距離（約0.5 cm）取0.2～0.3 mm厚的鹿茸組織樣品，用于組織學檢查，分析內部組織類型。將其余鹿茸樣品按照如下程序進行切片：用酒精噴燈將鹿茸表面的茸毛燎掉，擦洗干凈，去掉側枝；鮮茸放置到?20 ℃過夜冷凍，干茸用蒸汽蒸軟；然后，用手動參茸切片機切成約2 mm厚的薄片，觀察不同區段的組織結構和內部形態特點。

圖2 梅花鹿三杈鮮茸縱切面

按照行業標準所描述的鹿茸不同區段的特征和經驗，根據鹿茸縱向剖面和橫截面所展現出來的表型特征，對鹿茸進行分區。馬鹿三杈茸和梅花鹿三杈茸各分為7個區段，分別為蠟片區（wax-like，WL）、蠟粉片過渡區（WB）、粉片區（blood-color，BC）、粉蜂片過渡區（BH）、蜂片區（honeycomb-like，HL），蜂骨片過渡區（HB），骨片區（bone，B），共4個區段和3個過渡區段；梅花鹿二杠茸分為WL、BC、HL、B（鹿茸最基部約0.5 cm長的區段）4個區段。

2.3 組織學檢查

在縱向劈開的三杈鮮茸組織樣品，用10%的福爾馬林固定1周。用10%的甲酸脫鈣后，石蠟包埋，切片厚度為5 μm，用蘇木素和伊紅染色，阿利辛藍復染。重點觀察WL、BC、HL、B 4個區段鹿茸內部組織類型。

2.4 烘干和粉碎

鮮茸切片后，放?80 ℃預冷，然后用冷凍干燥機凍干；干茸切片后用65 ℃烘干。干制后的鹿茸片用中藥粉碎機粉碎，過100目篩。

2.5 HPLC分析

選擇凍干后粉碎的馬鹿和梅花鹿三杈茸，采用高效液相色譜法對鹿茸WL、BC、HL、B 4個區段的水溶性成分進行差異分析，主要分析4個區段的指紋圖譜和峰下面積的差異。

2.5.1 供試品溶液的制備 稱取凍干粉0.5 g，在50 mL離心管中用10 mL蒸餾水稀釋，置于超聲浴中，超聲30 min（50 kHz），離心15 min（10 000 r/min），收集上清液，用同樣方法再次提取殘渣，2次上清液合在一起，加水定容至25 mL。所得溶液通過0.45 μm濾膜濾過，濾液作為供試品溶液。

2.5.2 陰性對照溶液的制備 蒸餾水作為陰性對照溶液。

2.5.3 色譜條件 色譜分析使用Waters e2695系統（Waters，配2489UV檢測器，連接Waters Empower 3數據站），采用Pursuit XRs C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）在30 ℃下進行色譜分離。檢測波長260 nm，體積流量1 mL/min，每次進樣10 μL。流動相由甲醇（A）和水（B）組成，梯度洗脫：0～30 min，1%～10%A。該方法重復3次，獲得的結果均一致，作為本實驗的最終結果。

2.6 蛋白質含量測定

鮮茸和干茸各個區段的鹿茸粉，采用凱氏定氮法，參照AOAC的官方分析方法[18]進行蛋白質含量的測定。約0.2 g的鹿茸粉用15 mL H2SO4在420 ℃條件下處理2 h，冷卻后，滴定，總氮的量乘以6.25為蛋白質的量[19]。當2個獨立測定之間的絕對差異超過10%時，重復測定。

2.7 鈣含量測定

鮮茸和干茸各個區段的鹿茸粉，采用ICP-MS法，按照孫偉麗等[20]描述的方法，進行鈣含量的測定。

2.8 分區值（PV）計算

PV值的設立的計算公式如下

PV＝Cp/Cca×105

Cp為蛋白質的含量，Cca鈣的含量

WB、BH、HB的值分別用以區分WL、BC、HL、B。

2.9 統計分析

蛋白質含量、鈣含量、PV值的數值，采用GraphPad Prism 6軟件進行統計學分析并制圖。

3 結果

3.1 內部的組織結構

通過對鹿茸縱剖面（圖2）、各區段橫斷面（圖3）和組織學切片的觀察（圖4）得知，對于同一區段，不同規格鹿茸、鮮茸和干茸的內部組織結構和形態特點差別不明顯；而對于同一規格的鮮茸（或干茸）來說，不同區段之間差別明顯，組織類型也不一致，具體描述見表2。

A、D-干茸切片 E、H-鮮茸切片 A、E-蠟片（WL區），無肉眼可見血管，蠟質肉樣 B、F-粉片（BC區），細密均勻的血管 C、G-蜂片（HL區），周圍血管細，中央血管粗，類似蜂巢狀，開始出現密質骨（*處），但是有缺口（#處）沒有連成環 D、H-骨片（B區），血管變粗，密質骨（*處）連成環

A-WL區，間充質，形成表面覆蓋有成軟骨細胞（箭頭）的柱狀結構，內部含有軟骨細胞（箭頭），說明開始向軟骨轉化 B-BC區，軟骨組織，可見藍染的連續的軟骨柱，內部充滿軟骨細胞（箭頭），箭頭指向的為破軟骨細胞 C-HL區彌散的骨小梁依然可見大量的軟骨細胞（箭）和破軟骨細胞（*），表面覆蓋有成骨細胞（箭頭） D-B區，正在進行骨重建的骨小梁，成骨（箭頭）和破骨（箭頭）共存

表2 鹿茸4個區段內部組織特征和類型

通過肉眼觀察，發現3種規格鹿茸、鮮茸和干茸不同區段的共性差別在于血管形態、軟骨和骨柱及骨密質環，因此選擇這3個指標用于分區。4個區段骨化程度逐漸加深；肉眼可見血管從無（WL區，圖3-A、E）到有，并逐漸增粗，當肉眼可見血管布滿整個鹿茸橫斷面時，為BC區（圖3-B、F），此區段血管細密，粗細均勻；軟骨和骨柱分布均勻，骨密質環從無到有，當鹿茸橫斷面邊緣開始出現密質骨時，為HL區（圖3-C、G），此區段周圍血管細密，中間粗，呈蜂窩狀；軟骨和骨柱變得破損無序，當鹿茸橫斷面邊緣的密質骨連成環狀的骨密質環時，為B區（圖3-D、H），此區段周圍血管細密，中間更粗，形成血竇。

3.2 內部的組織類型

由梅花鹿三杈茸鮮茸不同區段的組織學切片（圖4）可以看出，WL區（圖4-A）形成表面覆蓋有成軟骨細胞的柱狀結構，內部含有軟骨細胞，此處已經開始從間充質向軟骨轉化。BC區（圖4-B）可見縱向血管分割的藍染的連續的軟骨柱，內部充滿軟骨細胞。HL區（圖4-C）可見彌散的骨小梁與血竇，內部依然含有大量的軟骨細胞和破軟骨細胞，表面覆蓋有成骨細胞。B區（圖4-D），由完整骨環圍繞的內部組織分布著正在進行骨重建的骨小梁和大量的血竇，成骨細胞和破骨細胞共存。

3.3 水溶性成分差異比較

同一區段的馬鹿和梅花鹿三杈鮮茸的HPLC色譜圖類似，同一鹿茸4個區段HPLC峰數量相近，色譜圖見圖5，峰面積見圖6，沒有顯著差異（0.05）。

圖5 馬鹿(A)和梅花鹿(B) 三杈鮮茸4個區段的HPLC色譜圖比較

圖6 馬鹿和梅花鹿三杈鮮茸HPLC總峰面積比較(n＝6)

不同區段之間，不論是馬鹿還是梅花鹿三杈鮮茸的HPLC色譜峰的數量基本相同（圖5）；但色譜峰面積差別較大（圖7），峰面積值從尖部到基部逐漸降低，其中馬鹿三杈鮮茸相鄰區段之間差別顯著（＜0.05、＜0.01），梅花鹿三杈鮮茸粉片和蜂片。之間差異顯著（＜0.05），總體趨勢為WL的峰值最高，BC、HL、B依次降低。

相鄰區段比較：*P＜0.05 ** P＜0.01

3.4 4個區段蛋白質含量的變化趨勢

鹿茸樣品的蛋白質含量在46.14%～85.56%。不同規格、同一區段鹿茸組織的蛋白質含量之間的差異不顯著，見圖8。除了馬鹿三杈茸的WB和HL（＜0.05）之外，其余區段的干茸和鮮茸之間的蛋白質含量的差異均不顯著，見圖9。

A-4個區段 B-3個過渡區段

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區段比較：*P＜0.05

3種規格鹿茸的蛋白質含量從尖部到基部均逐漸降低，WL、BC、HL、B4個區段的相鄰區段之間差異均達到顯著（＜0.05）或極顯著水平（＜0.01、0.001）；同一種鹿茸的4個區段蛋白質含量逐漸降低，而某些區段與其過渡區段（如馬鹿三杈茸BH與HL，梅花鹿三杈茸BC與BH、BH與HL、HL與HB）之間存在差異不顯著的現象，見圖10。

相鄰區段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.5 4個區段鈣含量的變化趨勢

鹿茸樣品的鈣含量在0.08%～18.51%。除馬鹿三杈茸和梅花鹿三杈茸在WB存在差異顯著（＜0.05）的現象之外，3種規格之間的同一區段鹿茸的鈣含量差異不顯著（＞0.05），見圖11。除馬鹿三杈茸的WB、梅花鹿三杈茸WL和BC存在差異顯著（＜0.05）的現象之外，其余區段的干茸和鮮茸之間的鈣含量差異均不顯著（＞0.05），見圖12。

A-4個區段 B-3個過渡區段 2種規格同一區段比較：*P＜0.05

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區段比較：*P＜0.05

3種規格鹿茸的鈣含量從尖部到基部均逐漸升高，WL、BC、HL和B 4個區段的相鄰區段之間差異均達到極顯著水平（＜0.01，0.001）；同一鹿茸4個區段鈣含量逐漸升高，而某些區段與其過渡區段（馬鹿三杈茸HL與HB，梅花鹿三杈茸BC與BH、HL與HB）之間存在差異不顯著（＞0.05）的現象，見圖13。

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 相鄰區段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

3.6 4個區段PV值大小的變化趨勢

通過蛋白質含量和鈣含量的比值設定的鹿茸PV值，數值范圍的跨度相比蛋白質含量和鈣含量都大，分布在2.75～600.32，所以更能顯著地區分不同區段。3種規格鹿茸之間的同一區段的PV值差異不顯著，見圖14。除梅花鹿三杈茸的BC存在顯著差異（＜0.05）的現象之外，其余區段的干茸和鮮茸的PV值差異均不顯著，見圖15。

圖14 3種規格鹿茸之間的同一區段PV值的比較

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 干茸和鮮茸同一區段比較：*P＜0.05

3種規格鹿茸的PV值從尖部到基部均逐漸降低，其中馬鹿和梅花鹿三杈茸的WL、BC、HL和B4個區段的相鄰區段之間的差異均達到顯著（＜0.05）或極顯著水平（＜0.01、0.001）；同一鹿茸4個區段PV值逐漸升高，而某些區段與其過渡區段（馬鹿三杈茸WB與BC，梅花鹿三杈茸WB與BC、BC與BH、BH與HL、HL與HB）之間存在差異不顯著的現象，梅花鹿二杠茸蜂片和粉片的PV值差異不顯著，見圖16。

A-馬鹿三杈茸 B-梅花鹿三杈茸 C-梅花鹿二杠茸 相鄰區段比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001

根據上述結果，將各區段的PV值進行統計學分析，結果見表3。選擇馬鹿和梅花鹿三杈茸過渡區的PV值共12個數據，去掉一個最高值和一個最低值，剩余10個數值的平均值作為相鄰區段間的界限值。WL區PV值≥65.00，BC區PV值為6.30～64.99，HL區PV值為4.70～6.29，B區PV值≤4.69。

表3 鹿茸不同區段PV值(n＝6)

4 討論

目前鹿茸分區方法混亂、客觀指標和質量標準缺乏等現狀，阻礙了鹿茸的深加工和藥用。因此，有必要建立科學的、精確的客觀鹿茸分區方法。我們認為客觀鹿茸分區方法，必須具備如下兩個條件：第一，無差別地適用于各種規格的鹿茸；第二，設有明顯的客觀指標。本研究根據不同區段鹿茸的內部組織結構和成分組成，首次設立了“血管形態”和“骨密質環”2個指標作為鹿茸分區的感官指標。同時首次根據鹿茸中蛋白和鈣含量比值設立“PV值”這一指標，通過客觀數值將各個區段進行了數據化，并為相鄰區段之間設立了明顯的界線，定義了每個區段的數值范圍，使鹿茸分區更為合理，還能將深加工鹿茸產品的原材料定位到鹿茸的某一區段。

不同區段鹿茸的組織結構、類型和成分組成各不相同。從鹿茸縱剖面（圖2）、橫斷面（圖3）和組織學切片（圖4）可以看出，不同區段組織結構和類型之間清晰的變化。本研究的組織學結果顯示：鹿茸4個區段骨化程度從尖部到基部逐漸增大，該結果與赤鹿[10]、白尾鹿[21]的研究結果一致。液相色譜分析、代謝組學[2, 22]分析結果顯示，鹿茸不同區段成分含量和種類均有一定程度的差異。理論推測，（1）可能是上述差異造成了不同區段鹿茸的藥效存在一定的差異，如鹿茸不同區段在抗骨質疏松方面的功效顯著不同[11]；（2）可以利用這種差異來區別鹿茸的不同區段。

對于不同區段鹿茸的成分含量，本研究通過對總水溶性成分含量（HPLC法測定）和單一種類（蛋白質和鈣）成分含量兩種方式進行分析。對同一區段來說，HPLC法測定的總水溶性成分含量在不同規格鹿茸之間差異不顯著，說明該方法能夠同時適用于3種規格的鹿茸，但是由于HPLC法不能有效地區分的梅花鹿三杈茸鮮茸的不同區段。因此，本研究中使用的HPLC測定法不滿足構建客觀鹿茸分區方法的條件。

3種規格鹿茸4個相鄰區段之間的PV值（圖16）達到差異顯著的水平（除梅花鹿二杠茸粉片和蜂片之間的PV值外）。相對于單一成分的蛋白質含量（圖10）和鈣的含量（圖13）來說，PV值的數值在各區段之間的差距更大，因此更靈敏，使分區效果更好。對于不同種類和規格的鹿茸來說，各區段的PV值處于同一水平（表1）：同一區段的馬鹿茸和梅花鹿茸的PV值之間沒有顯著差異（圖14）；同一區段的梅花鹿三杈茸和二杠茸的PV值之間沒有顯著差異（圖14）；同一區段的干茸和鮮茸的PV值之間沒有顯著差異（圖15）。上述結果說明，該PV值不僅適用于種間的鹿茸，不同規格的鹿茸，也能夠適用于不同加工方式處理的鹿茸。

梅花鹿二杠茸粉片和蜂片之間的PV值（圖16）出現了不顯著的現象。對于同一區段來說，3種規格的鹿茸、干茸和鮮茸之間的蛋白質含量、鈣含量和PV值也偶爾存在著差異顯著的現象。這是因為本研究中所用的樣品，全是采用傳統鹿茸分區方法進行劃分的，人為操作誤差較大。這一現象也證明了傳統鹿茸分區方法的可靠性較差。PV值的使用能很好地克服這一缺點。很多區段與其過渡區段之間的PV值差異不顯著（圖16），除傳統鹿茸分區方法的人為操作誤差因素外，還說明鹿茸4個區段之間存在一定的緩沖區，將鹿茸劃分為4個區段是合理的，如果再進行細化（如劃分為7個區段），會出現難以區分相鄰區段的現象。

綜上所述，本研究設立的PV值對鹿茸進行分區的方法具備了客觀鹿茸分區方法的必備條件。但是由于PV值測定較為繁瑣，因此應同時結合感官指標對鹿茸進行分區。對于難以確定區段歸屬的部分再進行PV值的測定，能夠得到較為精確的結果。

合理公認的鹿茸質量鑒定方法的缺乏，是鹿茸質量標準缺失的主要因素。本研究建立的客觀鹿茸分區方法，為建立現代化的鹿茸質量鑒定方法邁出了第一步，有助于鹿茸產業的深加工和走向標準化，同時還為建立動物藥甚至整個中藥的質量鑒定方法提供了示范。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] 中國藥典 [S].一部.2020: 263.

[2] 劉文媛, 李春義, 巴恒星, 等.鹿茸4個區段非靶向代謝組學研究 [J].吉林農業大學學報, 2020, 42(4): 454-466.

[3] Li C Y, Zhao H P, Liu Z,.Deer antler: A novel model for studying organ regeneration in mammals [J]., 2014, 56: 111-122.

[4] Goss R J.Section iii basic sciences and pathology 24 problems of antlerogenesis [J]., 1970, 69(1): 227-238.

[5] Suttie J M, Wenham G, Kay R N.Simplemethod for determining calcium and phosphorus content of the metacarpus of red deer using radiography [J]., 1983, 113(17): 393-394.

[6] Li C Y, Yang F H, Sheppard A.Adult stem cells and mammalian epimorphic regeneration-insights from studying annual renewal of deer antlers [J]., 2009, 4(3): 237-251.

[7] Stewart K M, Bowyer R T, Kie J G,.Antler size relative to body mass in moose: Tradeoffs associated with reproduction, [J]., 2000, 1: 59-63.

[8] Li C Y.Deer antler regeneration: A stem cell-based epimorphic process [J]., 2012, 96(1): 51-62.

[9] Sun H M, Yang F H, Chu W H,.Lentiviral-mediated RNAi knockdown of Cbfa1 gene inhibits endochondral ossification of antler stem cells in micromass culture [J]., 2012, 7(10): e47367.

[10] Li C, Clark D E, Lord E A,.Sampling technique to discriminate the different tissue layers of growing antler tips for gene discovery [J]., 2002, 268(2): 125-130.

[11] Tseng S H, Sung C H, Chen L G,.Comparison of chemical compositions and osteoprotective effects of different sections of velvet antler [J]., 2014, 151(1): 352-360.

[12] 張嵩, 李峰.不同規格鹿茸商品藥材中氨基酸含量分析 [J].中國中藥雜志, 2013, 38(12): 1919-1923.

[13] 王艷梅, 鄒興淮.東北梅花鹿茸不同部位總磷脂含量的比較分析 [J].經濟動物學報, 2003, 7(3): 30-31.

[14] 汪樹理, 潘浦群, 李曉紅, 等.4種東北梅花鹿茸片總糖與水溶性蛋白的分析 [J].經濟動物學報, 2007, 11(4): 194-195.

[15] 郭月秋, 陳代賢, 呂浩然.鹿茸片、粉及鹿角粉的薄層色譜鑒別 [J].中藥材, 2000, 23(3): 136-137.

[16] 陳代賢.鹿源系列中藥材真偽質量鑒別圖譜[M].北京: 中國醫藥科技出版社, 2003: 126.

[17] 郝林琳, 劉松財, 任曉慧, 等.馬鹿茸不同部位IGF-1含量的比較分析 [J].經濟動物學報, 2005, 9(4): 201-203.

[18] Latimer Jr G W.Official methods of analysis of AOAC International 20th edition, Appendix D, Guidelines for collaborative study procedures to validate characteristics of a method of analysis [J].2016, 16: 56-59.

[19] Kjeldahl J.Neue Methode zur Bestimmung des Stickstoffs in organischen K?rpern [J]., 1883, 22(1): 366-382.

[20] 孫偉麗, 趙海平, 張國坤, 等.不同加工方式對梅花鹿三叉茸不同區段礦物質元素含量的影響研究 [J].中草藥, 2018, 49(16): 3821-3828.

[21] Banks W J.The ossification process of the developing antler in the white-tailed deer () [J]., 1974, 14(4): 257-274.

[22] 孫偉麗, 趙海平, 王雪華, 等.基于代謝組學技術分析不同區段鹿茸差異代謝分子物質[J].中草藥, 2019, 50(20): 5047-5053.

Establishment of classification method for dividing velvet antler portions based on tissue structures and ratio of protein to calcium content

ZHAO Hai-ping1,3, YAO Meng-jie1, XU Yuan1, LIU Jia1, YUE Zhi-gang1, QI Xiao-yan1, LI Chun-yi2

1.Deer Antler Engineering Research Center, Institute of Special Animal and Plant Sciences of CAAS, Changchun 130112, China 2.Institute of Antler Science and Product Technology, Changchun Sci-Tech University, Changchun 130600, China 3.College of Animal Science and Technology, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China

To establish an objective classification method for dividing velvet antler (VA) portions.Three types of VA, including three-branched VA of wapiti, three-branched and two-branched VA of sika deer, were collected.To identify visual indicators of different portions, the VA internal tissue structure, morphological characteristics and tissue types of the longitudinal cut, crosscut and histological sections were analyzed.Differences in components of different VA portions were analyzed and partition index was set up.Morphological landmarks of blood vessels and ring of compact bone were found to be useful as two visual indicators for distinguishing the four VA portions.Wax-like (WL) slice: no visible blood vessel; Blood-color (BC) slice: fine-grained and uniformed blood vessels; Honeycomb-like (HL) slice: uniformed blood vessels and thicker in center, compact bone appeared at edge without connecting to a complete ring; Bone (B) slice: coarsened blood vessels and thicker in center, compact bone connecting to a complete ring.Portion value (PV), determined by using ratio of protein to calcium content, was applied to distinguish four VA portions: WL≥65.00; BC: 6.30—64.99; HL: 4.70—6.29; B≤4.69.The objective portion dividing method for VA was established based on the morphological landmarks and the PV in this study.It can accurately and objectively to distinguish four VA portions.They were not only suitable for different deer species, such as wapiti and sika deer VA; for different types of VA, such as two-branch and three-branch; but also for VA processed by different methods, such as traditionally cooking and modern freeze-drying.The established methods for dividing VA portions can be utilized for targeted use of VA to more specific symptoms in clinics, and for promoting development of deep-processing for deer industry.

velvet antlers; internal tissue structure; three-branched velvet antler of wapiti; three-branched velvet antler of sika deer; two-branched velvet antler; portion value

R286.2

A

0253 - 2670(2022)05 - 1518 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.05.028

2021-09-06

吉林省科技發展計劃項目（20190304006YY）

趙海平，男，副研究員，博士，主要從事鹿茸生物學和藥效方面研究。E-mail: zhperic@163.com

通信作者：李春義，研究員，主要從事鹿茸生物學和干細胞方面研究。E-mail: lichunyi1959@163.com

[責任編輯 時圣明]