bFGF對(duì)3-硝基丙酸處理的小鼠受精卵體外發(fā)育能力的影響

田 微，方妍雅，柳海星，李鐘淑

(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院，延吉 133000)

卵巢氧化應(yīng)激通過(guò)影響卵母細(xì)胞發(fā)生、卵泡發(fā)育、卵泡成熟和卵泡破裂等影響卵母細(xì)胞質(zhì)量及早期胚胎發(fā)育，最終導(dǎo)致雌性生殖機(jī)能下降[1]。卵巢中活性氧(ROS)的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)引起氧化應(yīng)激，從而影響卵母細(xì)胞質(zhì)量和輔助生殖技術(shù)(ART)的結(jié)果。建立哺乳動(dòng)物早期胚胎體外培養(yǎng)體系是人工輔助生殖技術(shù)的關(guān)鍵，如何獲得大量且優(yōu)質(zhì)的胚胎是研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。小鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在人工輔助生殖技術(shù)中發(fā)揮著重要作用。如何通過(guò)提高小鼠體外發(fā)育囊胚率而增加胚胎體外發(fā)育能力，是研究早期胚胎體外發(fā)育的重點(diǎn)。因此，建立相關(guān)氧化應(yīng)激模型對(duì)開(kāi)展該方面研究具有重要意義。

3-硝基丙基酸(3-nitroponic acid,3-NPA)能誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生和釋放ROS，從而致使線粒體DNA發(fā)生損壞，進(jìn)而線粒體功能會(huì)受到很大的影響[2]。細(xì)胞內(nèi)三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate，ATP)的產(chǎn)生主要發(fā)生在線粒體，線粒體的形態(tài)和位置發(fā)生改變出現(xiàn)在胚胎早期發(fā)育時(shí)期，線粒體氧化磷酸化能力被異常的線粒體分布所影響，線粒體內(nèi)發(fā)生一系列異常變化而影響早期胚胎的發(fā)育。3-NPA是一種在動(dòng)物生產(chǎn)中較為常見(jiàn)的對(duì)動(dòng)物體有毒性的化合物，可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激從而降低生產(chǎn)力。研究表明，利用3-NPA構(gòu)建小鼠氧化應(yīng)激模型，具有時(shí)間短(7 d)、操作簡(jiǎn)單、效果顯著等優(yōu)點(diǎn)。張家慶[3]、王慧瑞等[4]研究結(jié)果表明，連續(xù)7 d、每天2次給小鼠注射12.5 mg/kg 3-NPA可使小鼠卵巢達(dá)到氧化應(yīng)激狀態(tài)，從而產(chǎn)生氧化應(yīng)激的早期胚胎，在早期胚胎體外培養(yǎng)液中加入抗氧化劑可以調(diào)節(jié)線粒體損傷引起的氧化應(yīng)激。說(shuō)明在胚胎體外培養(yǎng)液中加入抗氧化劑是抵抗氧化劑引起的氧化應(yīng)激最直接有效的方法之一。

堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)是一種在細(xì)胞體外培養(yǎng)增殖、誘導(dǎo)分化以及體外組織再生領(lǐng)域均有較大應(yīng)用潛力的生長(zhǎng)因子之一[5]。研究表明，bFGF可通過(guò)提高超氧化物歧化酶的活性，增強(qiáng)對(duì)ROS的清除能力，在胚胎及細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用[6]。據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)顯示，bFGF具有一定的對(duì)抗氧化應(yīng)激的作用[7]，但bFGF在動(dòng)物生殖系統(tǒng)特別是在卵母細(xì)胞和早期胚胎體外發(fā)育中的具體作用仍不清楚。本試驗(yàn)擬通過(guò)在體外培養(yǎng)液中添加bFGF，探討bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響，以期為提高氧化應(yīng)激早期胚胎體外發(fā)育質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 本試驗(yàn)中使用的繁殖雄鼠：7～8周齡、健康(單籠飼養(yǎng)，種用壽命為半年)、體重25 g以上；雌鼠：6～8周齡、體重25 g以上；均達(dá)到性成熟，均購(gòu)自延邊大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。在室內(nèi)光暗周期為12 h∶12 h、溫度為22～23 ℃的環(huán)境中飼養(yǎng)，保持良好通風(fēng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 CZB-HEPES、透明質(zhì)酸酶(Hy)、磷酸鹽緩沖溶液(PBS)均購(gòu)自Sigma公司；JC-1、ROS(DCFH-DA)和谷胱甘肽(GSH)(CMF2HC)均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；孕馬血清促性腺激素(PMSG)、人絨毛膜促性腺激素(hCG)均購(gòu)自寧波第二激素廠；bFGF購(gòu)自Sino Biological公司；KSOM培養(yǎng)液購(gòu)自南京愛(ài)貝生物公司。體視顯微鏡(TMS)和熒光顯微鏡(Lecia DM IRB)均購(gòu)自Nikon公司；CO2培養(yǎng)箱(TH3111)購(gòu)自ESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 受精卵的采集 采用PMSG-hCG法對(duì)挑選的6～8周齡雌鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，即于第1天注射0.1 mL(10 IU) PMSG促進(jìn)小鼠卵母細(xì)胞成熟，48 h后注射0.1 mL(10 IU) hCG誘導(dǎo)小鼠排卵，注射hCG后立即與成年公鼠1∶1合籠，在合籠20 h后采用頸部脫臼處死小鼠，無(wú)菌手術(shù)摘取輸卵管，放入已經(jīng)預(yù)平衡的CZB-HEPES中，體視顯微鏡下劃破輸卵管膨大部，收集受精卵。將受精卵移入0.1%透明質(zhì)酸酶中消化2 min，吹打以去除卵丘細(xì)胞，將受精卵在CZB-HEPES中洗3次，收集含有雙原核的受精卵。

1.2.2 最佳bFGF濃度篩選 將雙原核受精卵放入已經(jīng)預(yù)平衡的KSOM培養(yǎng)液中。 KSOM中分別添加0、20、50、100和150 ng/mL bFGF，于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)的24、48和96 h觀察胚胎發(fā)育情況，并統(tǒng)計(jì)2-細(xì)胞率、4-細(xì)胞率和囊胚率，篩選出最佳bFGF處理濃度，以用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.3 3-NPA氧化應(yīng)激處理及受精卵的分組 小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后，經(jīng)腹腔注射12.5 mg/kg 3-NPA，2次/d，注射7 d，構(gòu)建小鼠卵巢氧化應(yīng)激模型[3]。3-NPA注射7 d后按照1.2.1的方法進(jìn)行超數(shù)排卵、合籠及受精卵收集。將受精卵分為對(duì)照組(C)、bFGF組、3-NPA組和3-NPA+bFGF組，其中對(duì)照組和bFGF組為正常組小鼠的受精卵，3-NPA組和3-NPA+bFGF組為體內(nèi)注射3-NPA小鼠的受精卵。 在體外培養(yǎng)時(shí)，bFGF組和3-NPA+bFGF組KSOM培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF，對(duì)照組和3-NPA組KSOM培養(yǎng)液中不添加bFGF，胚胎分別用相應(yīng)培養(yǎng)液清洗3次后移入各組培養(yǎng)液微滴中，于37.5 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96 h，得到的囊胚用于ROS、GSH和線粒體膜電位檢測(cè)。

1.2.4 ROS水平的檢測(cè) 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到DCFH-DA微滴中。 放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育15 min，再用PVA洗3次，在熒光顯微鏡綠色熒光下拍照。操作全過(guò)程應(yīng)避光進(jìn)行。用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行量化分析，每組試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.5 GSH水平的檢測(cè) 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到CMF2HC微滴中。 放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育20 min，再用PVA洗3次，在熒光顯微鏡藍(lán)色熒光下拍照。 操作全過(guò)程應(yīng)避光進(jìn)行。用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行量化分析，每組試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.2.6 線粒體膜電位的檢測(cè) 將1.2.3獲得的囊胚在PVA中洗3次，然后轉(zhuǎn)移到JC-1的微滴中。放入CO2恒溫培養(yǎng)箱中孵育25 min，再用PVA洗滌3次，在熒光顯微鏡紅色、綠色熒光下拍照，通過(guò)紅/綠熒光強(qiáng)度的比例來(lái)衡量線粒體膜電位強(qiáng)度。操作全過(guò)程應(yīng)避光進(jìn)行，用ImageJ 1.48軟件進(jìn)行量化分析處理，每組試驗(yàn)重復(fù)5次。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0進(jìn)行單因素方差分析，用LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間多重比較，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 最佳bFGF濃度篩選

由表1可知，各組2-細(xì)胞率無(wú)顯著差異(P>0.05)，150 ng/mL bFGF組4-細(xì)胞率和囊胚率均顯著低于其他組(P<0.05)，100 ng/mL bFGF組囊胚率顯著高于其他組(P<0.05)。因此，小鼠胚胎的最適bFGF處理濃度為100 ng/mL。

表1 各組小鼠早期胚胎體外培養(yǎng)的發(fā)育率

2.2 bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響

由表2可知，各組間2-細(xì)胞率差異均不顯著(P>0.05)，3-NPA組4-細(xì)胞率顯著低于其他組(P<0.05)，bFGF組囊胚率顯著高于其他組(P<0.05)，3-NPA+bFGF組與對(duì)照組4-細(xì)胞率和囊胚率差異均不顯著(P>0.05)，且均顯著高于3-NPA處理組(P<0.05)。

表2 bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育的影響

2.3 bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠囊胚ROS水平的影響

由圖1可知，與對(duì)照組相比，3-NPA組ROS水平顯著升高(P<0.05)。3-NPA+bFGF組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，并均顯著低于3-NPA組(P<0.05)。

①A，DCHFDA染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果。②a～d，分別代表C、bFGF、3-NPA和3-NPA+bFGF組。圖2同

2.4 bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠囊胚GSH水平的影響

由圖2可知，與對(duì)照組相比，3-NPA處理組的GSH水平顯著降低(P<0.05)，bFGF組GSH水平顯著高于其他各組(P<0.05)；3-NPA+bFGF處理組與對(duì)照組差異不顯著(P>0.05)，且顯著高于3-NPA組(P<0.05)。

A，DCHFDA染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果

2.5 bFGF添加對(duì)3-NPA處理的小鼠囊胚中線粒體膜電位水平的影響

由圖3可知，與對(duì)照組相比，3-NPA組線粒體膜電位水平顯著降低(P<0.05)，bFGF組線粒體膜電位顯著增加(P<0.05)。3-NPA+bFGF組與對(duì)照組線粒體膜電位差異不顯著(P>0.05)，并均顯著高于3-NPA組(P<0.05)。

A，JC-1染色結(jié)果(100×)；B，量化結(jié)果

3 討 論

為了探究bFGF對(duì)3-NPA處理的小鼠受精卵體外發(fā)育能力的影響，本試驗(yàn)檢測(cè)了不同濃度bFGF(0、20、50、100和150 ng/mL)對(duì)小鼠受精卵分裂率和囊胚率的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，在3-NPA處理的小鼠受精卵體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以顯著提高囊胚率。研究表明，ROS和抗氧化物存在于卵泡液和輸卵管中，在母鼠妊娠時(shí)期，氧化應(yīng)激可直接調(diào)控發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)或通過(guò)間接氧化損傷細(xì)胞中的脂類和蛋白等成份，從而對(duì)胚胎發(fā)育和受孕造成嚴(yán)重危害[8-9]。本研究在培養(yǎng)液中添加bFGF可以降低胚胎發(fā)育過(guò)程中ROS的產(chǎn)生，從而提高小鼠受精卵的體外發(fā)育能力，這與毛挺挺等[10]研究結(jié)果一致。

已有研究表明，氧化劑3-NPA能特異地提高卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中ROS的水平，從而引起顆粒細(xì)胞凋亡與卵泡閉鎖[11]。有研究報(bào)道，在卵母細(xì)胞和胚胎中產(chǎn)生過(guò)量的ROS會(huì)導(dǎo)致其發(fā)生氧化應(yīng)激，卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育能力也會(huì)降低，在壁顆粒細(xì)胞和卵丘顆粒細(xì)胞中產(chǎn)生過(guò)量的ROS也會(huì)降低受精率和胚胎質(zhì)量。此外，ROS還參與早期胚胎發(fā)育阻滯，如小鼠2-細(xì)胞胚胎發(fā)育阻滯與ROS的升高密切相關(guān)[12]。bFGF作為抗氧化修復(fù)劑能夠促進(jìn)多種神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與3-NPA組相比，bFGF+3-NPA組顯著降低3-NPA處理小鼠囊胚ROS水平，說(shuō)明bFGF能夠克服3-NPA誘導(dǎo)小鼠早期胚胎氧化應(yīng)激并增強(qiáng)了胚胎的體外發(fā)育能力。GSH帶有的巰基(-SH)通過(guò)抗氧化作用能夠清除內(nèi)源和外源性有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的損傷[14]。同時(shí)，它在新陳代謝和調(diào)節(jié)全身穩(wěn)態(tài)所必需的途徑方面也具有至關(guān)重要的作用[15]。在體外培養(yǎng)過(guò)程中，胚胎內(nèi)的GSH水平與細(xì)胞增殖、胚胎成熟發(fā)育等過(guò)程相關(guān)[16]。本研究結(jié)果表明，與3-NPA組相比，bFGF+3-NPA組顯著提高了3-NPA處理小鼠囊胚的GSH水平，說(shuō)明bFGF減輕了3-NPA處理小鼠胚胎的氧化應(yīng)激并提高了胚胎的抗氧化能力。將不同試驗(yàn)組GSH與ROS水平比較發(fā)現(xiàn)，其處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，即胚胎內(nèi)GSH水平高時(shí)其ROS水平較低。對(duì)排卵前卵泡的研究表明，F(xiàn)SH可以抑制培養(yǎng)48 h卵泡中GSH水平的下降,FSH誘導(dǎo)的GSH增加與谷氨酸半胱氨酸連接酶(GCLM)蛋白水平的增加和ROS產(chǎn)生的抑制有關(guān)[17]。本試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以有效提高3-NPA處理的小鼠囊胚GSH水平，進(jìn)一步證實(shí)bFGF可以通過(guò)維持胚胎內(nèi)GSH水平對(duì)抗氧化損傷，從而提高小鼠早期胚胎體外發(fā)育的能力。

3-NPA能夠抑制細(xì)胞線粒體功能，從而導(dǎo)致細(xì)胞缺乏ATP[18]，還可誘導(dǎo)線粒體產(chǎn)生和釋放ROS，從而發(fā)生氧化應(yīng)激[19]。線粒體通過(guò)氧化磷酸化產(chǎn)生供細(xì)胞周期分裂和代謝等生命活動(dòng)所需的能量，參與ROS引起的細(xì)胞凋亡過(guò)程，調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化應(yīng)激，是消耗細(xì)胞內(nèi)氧化物的主要場(chǎng)所，影響細(xì)胞的新陳代謝和生長(zhǎng)，在胚胎發(fā)育的各個(gè)時(shí)期均起重要作用。早期胚胎發(fā)育的阻滯與早期細(xì)胞部分凋亡的現(xiàn)象均與線粒體功能障礙有關(guān)，發(fā)育的阻滯與早期凋亡會(huì)導(dǎo)致早期胚胎發(fā)育能力的降低[20]。胚胎內(nèi)線粒體膜電位水平與胚胎的發(fā)育能力成正相關(guān)，即膜電位水平增高則胚胎的發(fā)育能力增強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，100 ng/mL bFGF顯著提高了3-NPA處理小鼠囊胚期胚胎的線粒體膜電位水平。說(shuō)明在體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以有效維持3-NPA處理小鼠囊胚的線粒體膜電位穩(wěn)定。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，在小鼠受精卵體外培養(yǎng)液中添加100 ng/mL bFGF可以提高3-NPA誘導(dǎo)的小鼠受精卵的4-細(xì)胞率及囊胚率，顯著提高囊胚的GSH和線粒體膜電位水平，降低ROS水平，從而提高氧化應(yīng)激早期胚胎體外發(fā)育的能力。