脂聯素及其受體激動劑在禽脂肪性肝病中的應用展望

崔埕瑜，馬 賁，趙佳慧，趙梓娟，陳 雨，曹中贊，欒新紅

(沈陽農業大學動物科學與醫學學院，沈陽 110161)

脂聯素(adiponectin)是一種由脂肪組織分泌的細胞因子。脂聯素參與調控糖和脂質代謝、能量調節、免疫反應以及抵抗炎癥、氧化應激和細胞凋亡等多種生理功能、分子和細胞事件[1]。盡管脂聯素主要由脂肪組織分泌，但研究表明，在人和鼠的骨髓、成骨細胞、胎兒組織、心肌細胞和唾液腺上皮細胞中也有表達[2]。此外，雞和鵝等禽類的垂體、下丘腦、肝臟、骨骼肌、卵巢、脾臟和腎臟等組織均可表達脂聯素[3-4]。肝臟是脂聯素的主要靶器官，尤其是在脂肪性肝病中，脂聯素具有控制脂類代謝、炎癥和纖維化等多種肝功能的能力，在不久的將來，脂聯素或可能在預防和治療禽類乃至其他動物脂肪性肝病方面發揮重要作用。

1 脂聯素及其受體

1.1 脂聯素及其分子結構

脂聯素是一種分子質量約為30 ku的單體糖蛋白。小鼠脂聯素由247個氨基酸組成，人脂聯素由244個氨基酸組成，雞和鵝的脂聯素由245個氨基酸組成[3-4]。 脂聯素由N端信號序列、高變非同源區、含有22個膠原重復序列(8個Gly-X-Pro和14個Gly-X-Y)的膠原結構域和C端C1q樣球狀結構域組成。脂聯素的N端高變區包含一個半胱氨酸殘基(小鼠中的Cys-39或人類中的Cys-36)，半胱氨酸殘基在脂聯素三聚體通過其二硫鍵形成多聚體的過程中扮演重要角色[5]。 球狀結構域和補體因子C1q、Ⅷ型和Ⅹ型膠原以及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)等其他蛋白質的結構相似[6]。

最初分泌的脂聯素是一種被稱為全長脂聯素(full-length adiponectin，fAd)的單體，在血漿中形成不同分子質量的復合物。在局部微環境中，fAd可以被活化的單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞分泌的彈性蛋白酶切割成“球狀”脂聯素(globular form adiponectin，gAd)[7]。在血漿中，脂聯素有3種不同分子質量大小的多聚體復合物，即低分子質量三聚體(LMW，大約90 ku)、中分子質量六聚體(MMW，大約180 ku)和由12～18單聚體組成的高分子質量(HMW，360～540 ku)多聚體，每種多聚體都有不同的生物學功能[8]。

1.2 脂聯素受體及其信號通路

脂聯素主要通過AdipoR1和AdipoR2兩種受體發揮生物學功能。AdipoR1和AdipoR2屬于七次跨膜結構域受體蛋白家族，與其他G-蛋白偶聯受體家族的拓撲結構相反，氨基末端存在于細胞內，羧基末端存在于細胞外。AdipoR1基因編碼375個氨基酸的蛋白質，預測分子質量為42.4 ku，AdipoR2基因編碼311個氨基酸的蛋白質，預測分子質量為35.4 ku，這兩種受體的蛋白質序列有67%的相似性。兩種受體蛋白高度保守，小鼠和人的AdipoR1和AdipoR2蛋白分別有95%和97%的相似性。AdipoR1和AdipoR2表達廣泛，AdipoR1在骨骼肌和肝臟等各種組織中都有表達，尤其在肌肉組織中表達更高，AdipoR2主要在肝臟中表達。AdipoR1對球狀脂聯素具有高親和力，對全長脂聯素的親和力則較低，而AdipoR2對球狀脂聯素和全長脂聯素具有中等程度的親和力[9]。AdipoR1和AdipoR2含有一個由3個組胺殘基協調的鋅結合催化位點，接近質膜內表面。脂聯素受體的細胞外C末端與脂聯素相結合，細胞內N末端與適應性蛋白1(adaptor protein1，APPL1)相結合[10]。APPL1也稱為“銜接蛋白”，包含pleckstrin同源結構域(PH)、磷酸酪氨酸結構域(PTB)和亮氨酸拉鏈基序，APPL1通過其C末端PTB(phosphotyrosine-binding)和CC(coiled-coil)結構域直接與AdipoR1和AdipoR2的細胞內區域結合。APPL1參與AdipoR1和AdipoR2介導腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、過氧化物酶體增殖活化受體α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)、Ras樣GTP酶蛋白5(Rab5)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)和神經酰胺激活的下游效應，包括增加葡萄糖攝取和脂質氧化、血管舒張、線粒體生物發生與氧化能力、胰島素抗性。脂聯素通過其受體AdipoR1和AdipoR2與APPL1結合，在骨骼肌、肝臟、心臟、腎臟和胰腺等多種靶組織中啟動一系列下游信號傳導事件。研究表明，球狀和全長脂聯素能通過激活AdipoR1和AdipoR2促進AMPK和p38 MAPK的磷酸化，增加PPARα配體的活性，抑制脂肪酸的合成，使脂肪酸氧化和葡萄糖利用增加[11]。

2 脂聯素與脂肪性肝病

2.1 脂聯素與肝臟脂類代謝

脂聯素對脂類代謝的調控作用主要通過調控甘油三酯(triacylglyceride，TG)合成和脂肪酸氧化兩條主要途徑完成。家禽尤其是水禽(鴨和鵝)的脂類主要來源于內源性的肝臟合成[12]。禽類脂肪的主要形式是TG，在肝臟中，TG合成主要包括脂肪酸從頭合成，以及脂肪酸酯化形成TG兩個過程。首先，葡萄糖在肝臟中經過糖酵解反應轉化為丙酮酸，丙酮酸進入線粒體后經過三羧酸循環，形成乙酰輔酶A；乙酰輔酶A在乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的作用下，轉化為丙二酸單酰輔酶A，進而經過脂肪酸合成酶(fatty acid synthetase,FAS)的催化，形成不同長度的脂肪酸[13]。合成的脂肪酸在脂肪酸延長酶(elongation of very long chain fatty acids，ELOVL)和硬脂酰輔酶A去飽和酶(stearyl coenzyme A dehydrogenase-1，SCD-1)的作用下，進行碳鏈的延長與去飽和，形成各種長度和飽和度的脂肪酸，其中單不飽和脂肪酸優先酯化形成TG。脂肪酸從頭合成的速度主要在轉錄水平被調控，在此過程中，ACC、FAS和SCD-1是催化脂肪酸合成和酯化成TG的關鍵酶，固醇調節元件結合蛋白1c(sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c)是調控ACC、FAS和SCD-1的轉錄因子[14]。脂聯素可以通過與其特異性受體AdipoR1結合激活AMPK，活化的AMPK使SREBP-1c的Ser372位點發生磷酸化，抑制SREBP-1c的轉錄活性，繼而減少ACC、FAS和SCD-1等基因的轉錄[15-16]。

除形成TG外，肝臟合成的脂肪酸還以β氧化的方式在線粒體、內質網和過氧化物酶體等細胞器中在脂酰輔酶A氧化酶(acyl-CoA oxidase，ACO)催化作用下，進行脂肪酸氧化降解成乙酰輔酶A，為肝臟活動提供能量。其中，短鏈和中鏈脂肪酸不需要激活可自由穿過細胞膜進入細胞器中。長鏈脂肪酸需要經肉堿棕櫚酰轉移酶1(carnitine palmitoyltransferase 1，CPT-1)轉運穿過細胞膜。CPT1是脂肪酸β氧化的限速酶，能夠從細胞質中將脂肪酸轉移到線粒體中[17]。脂肪酸β氧化過程中這些關鍵酶基因的表達主要受PPARα轉錄調控[18]。激活PPARα可以促進脂肪酸β氧化，減少和阻礙肝臟脂肪積累。脂聯素能通過與其受體AdipoR2結合，觸發PPARα信號通路，激活其下游靶基因的轉錄，促進肝臟中脂肪酸氧化和脂質分解代謝[9，19]。此外，脂聯素活化的AMPK也可以導致PPARα的磷酸化，從而使PPARα活化，PPARα與AMPK相互協同上調CPT-1和ACO的表達，增加脂肪酸氧化，并阻礙脂質合成。再者，由于ACCα能催化丙二酰輔酶A的合成，丙二酰輔酶A是CPT-1的有效抑制劑，脂聯素激活的AMPK可以調控ACCα的磷酸化，導致ACCα活性的抑制以及隨之而來的丙二酰輔酶A的降低，減少對CPT-1活性的抑制，從而促進脂肪酸氧化[18]。

當肝臟中所產生的脂肪酸超過了通過β氧化途徑所降解的脂肪酸量，以及以脂蛋白的形式通過血液從肝臟轉運到外周組織所消耗的量時，就會造成脂肪在肝細胞中大量堆積，導致肝臟脂肪變性。脂聯素可以通過上述調控途徑減少脂肪酸和TG合成，刺激脂肪酸氧化，避免肝臟脂質的異常積聚，預防脂肪性肝病的發生[20-21]。

2.2 脂聯素與肝臟炎癥

當肝臟脂質代謝異常時，肝臟中過量積累的TG會對肝細胞產生毒性，大量的炎癥因子如TNF-α和白細胞介素1β(IL-1β)等就會釋放出來，從而誘發炎癥。此外，肝臟脂質代謝導致的血漿游離脂肪酸(free fatty acid，FFA)水平升高可激活巨噬細胞和脂肪細胞表面的Toll樣受體4(TLR4)，進而誘導脂肪性肝病的炎癥反應[22]。再者，FFA可刺激Bax(Bcl-2 associated X protein)進入溶酶體，促進組織蛋白酶B(cathepsin B)釋放入細胞質，進而通過核因子-κB(nuclear factor kappaB，NF-κB)上調TNF-α的表達，反過來，TNF-α又可誘導TG在肝內積聚，導致肝細胞脂肪變性，并可以增加溶酶體通透性激活NF-κB，從而使肝損傷的惡性循環持久化[23]。越來越多的證據表明，脂聯素具有抗炎作用[24]。脂聯素抗炎作用的主要靶點是單核細胞和巨噬細胞。單核細胞和巨噬細胞是非特異性和特異性免疫反應的關鍵調節因子，它們的功能包括吞噬外來抗原、抗原呈遞和產生促炎和抗炎細胞因子。脂聯素受體AdipoR1和AdipoR2在巨噬細胞中都能表達，并由PPAR配體調節。 在單核細胞中，AdipoR1比AdipoR2更豐富，其表達在單核細胞分化為成熟巨噬細胞時降低，而AdipoR2的表達則保持恒定，是單核細胞主要的脂聯素受體[25]。脂聯素能抑制髓系祖細胞分化，調節巨噬細胞功能和/或降低TLR4的表達。脂聯素可以通過降低NF-κB信號活性抑制有促炎作用的M1巨噬細胞的活化，選擇性激活有抗炎作用的M2巨噬細胞增殖來促進抗炎[26]。在巨噬細胞和其他單核細胞中，脂聯素能夠抑制炎性細胞因子(包括TNF-α、γ干擾素(IFN-γ)、IL-6和IL-1)的表達，以及誘導抗炎信號分子(如IL-10、IL-1R頡頏劑和血紅素氧合酶-1(HO-1))的生成[27-28]。

炎性細胞因子是肝臟炎癥、細胞死亡和纖維化以及不同程度肝損傷后再生的關鍵調控物質。在各種類型脂肪性肝炎的動物模型中，外源性脂聯素可顯著降低高脂飼糧、酒精或脂多糖等誘導的肝臟腫大，增加脂肪酸氧化，減少脂質積聚，抑制肝臟炎癥，降低肝臟組織和血漿中的TNF-α水平[29-30]。體外細胞試驗表明，脂聯素能使乙醇誘導的肝臟巨噬細胞中TLR-4介導的信號正常化，并通過抑制ERK和p38 MAPK信號使脂多糖(LPS)誘導的肝臟枯否細胞等巨噬細胞中的細胞因子TNF-α的產生正常化，從而起到保肝作用[28,31]。此外，脂聯素與TNF-α具有相似的結構和相同的信號通路，因此脂聯素可以頡頏TNF-α，減輕肝臟炎癥[32]。另外，由于TNF-α可以通過干擾SREBP-1c等關鍵轉錄調節因子使脂質合成增加[33]，脂聯素能通過對抗TNF-α來減少肝臟脂質積聚[34]。

2.3 脂聯素與肝臟氧化應激

脂肪性肝病能損害肝細胞線粒體，導致脂肪酸β氧化增加，產生過多活性氧(reactive oxygen species，ROS)自由基，引起氧化應激。氧化應激又可促進NF-κB的活化，介導大量編碼促炎細胞因子(IL-1α、IL-1β、TNF-α、IL-6)基因的轉錄，進一步加重肝臟脂肪性炎癥損傷[35]。研究表明，脂聯素具有廣泛的抗機體組織氧化應激的功能。脂聯素通過與其受體結合能增加過氧化氫酶(catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的表達，減輕氧化應激[36]。Ikegami等[37]采用重組脂聯素處理原代培養骨骼肌細胞，發現細胞內重鏈鐵蛋白、SOD和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)的表達上升，ROS水平下降。Li等[38]發現在高糖環境下，脂聯素可以增加心肌細胞的抗氧化能力，減少氧化應激反應和細胞凋亡，保護心肌細胞。Ren等[39]發現，脂聯素預處理能顯著抑制骨骼肌細胞C2C12中ROS水平，增強抗氧化物質核因子E2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor，Nrf2)和血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)的表達，顯著抑制線粒體膜電位的下降，增強細胞的抗氧化能力。此外，重組人脂聯素蛋白在維持鼠海馬神經元HT22細胞線粒體超微結構和跨膜電位，減少ROS、丙二醛(malonic dialdehyde，MDA)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)產生，增加SOD和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性，降低線粒體氧化應激對細胞造成的損傷等方面發揮重要作用[40]。

ROS的過量產生是啟動肝臟炎癥反應的重要因素。脂聯素可調節肝臟枯否細胞等巨噬細胞中ROS的產生。外源脂聯素處理能降低LPS刺激誘導的經乙醇飼喂后的小鼠肝臟枯否細胞中的ROS產生[41]。此外，球狀脂聯素通過調節巨噬細胞內NADPH氧化酶阻止乙醇誘導的ROS生成[42]。脂聯素對肝臟產生ROS信號通路的負向調控，可能有助于其對肝臟炎癥的保護作用。

2.4 脂聯素與肝細胞凋亡和自噬

肝臟中飽和脂肪酸的增加會激活肝細胞凋亡，促進脂肪性肝損傷的發生。研究表明，脂聯素與其受體相結合可通過多種信號通路調控細胞的增殖和凋亡。脂聯素能夠通過抑制細胞外調節蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2)信號通路的激活，以及通過激活PI3K/AKT信號通路降低Caspase-3的活性，抑制棕櫚酸誘導的鼠源心肌細胞H9c2的凋亡[43]。重組人脂聯素蛋白能通過激活Janus蛋白酪氨酸激酶2/信號轉導子和轉錄激活子3(JAK2/STAT3)信號通路，繼而上調Bcl-2蛋白和下調Bax蛋白的表達，降低Caspase-3水平，抑制缺氧和缺糖導致的鼠海馬神經元HT22細胞凋亡的發生[40]。 肝臟星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)和枯否細胞都有AdipoR1和AdipoR2表達。HSC在肝臟受到損傷后被激活，促使膠原分泌和瘢痕組織的形成，導致慢性纖維化或肝硬化。枯否細胞是肝臟損傷和修復的關鍵介質。慢性炎癥誘導的肝細胞壞死和凋亡導致枯否細胞通過TLR-4信號途徑釋放炎癥介質，這些炎癥介質誘導HSC的激活，藉此吞噬死亡的肝細胞[28]。脂聯素能抑制枯否細胞TLR-4信號，抑制HSCs的增殖和遷移，同時也能使其易于發生Caspase介導的凋亡[44]。

自噬是一種細胞應激適應機制，能通過抑制凋亡避免細胞死亡[45]。自噬過程的激活保證了線粒體受損細胞結構的去除，從而防止線粒體損傷引起的氧化應激和細胞壞死[46]。脂聯素與自噬激活之間的相關性已在多種細胞中被報道[47-48]。自噬作為一種細胞適應性機制被激活，能防止肝損傷引起的細胞損傷。脂聯素能誘導自噬的激活從而保護肝細胞免受乙醇誘導的凋亡，AMPK信號途徑在誘導自噬中扮演著重要角色，脂聯素能通過與其受體結合激活AMPK誘導自噬，沉默AMPK能干擾脂聯素誘導的自噬基因的表達，從而阻止對乙醇誘導的細胞凋亡的保護[49]。脂聯素誘導的自噬可能在其發揮保肝作用方面起著主導作用，通過給予脂聯素激活自噬，能夠緩解或改善酒精性和非酒精性脂肪肝、肝纖維化和病毒性肝炎等肝臟疾病[50]。

3 脂聯素受體激動劑

目前對脂聯素的研究較多，但由于單體形式的脂聯素不能發揮作用，人工合成的脂聯素多聚體結構又不穩定，而且體內脂聯素需要較高的血漿濃度，這些均限制了脂聯素在臨床醫學上的直接應用[51]。然而在對脂聯素的作用機制研究過程中發現，AdipoR1和AdipoR2在調節機體糖脂代謝、炎癥和氧化應激方面扮演重要角色，在肝臟中AdipoR1表達上調激活AMPK，而AdipoR2表達上調激活PPARα，從而發揮其促進脂肪酸燃燒和能量消耗，介導抗炎和抗氧化應激作用。因此，另一種可以替代脂聯素的策略是尋找能激活AdipoR1和AdipoR2的小分子化合物，激活脂聯素受體，并以此發揮與脂聯素相同的生物學作用。

2013年，東京大學藥物研究所的Okada-Iwabu等[52]對大量能夠結合并激動脂聯素受體的小分子化合物進行了篩選，獲得了與脂聯素作用相似的小分子化合物，將其中一種命名為AdipoRon，并發現這種小分子脂聯素受體激動劑在體外可以與AdipoR1和AdipoR2結合，激活AMPK和PPARα信號通路，表現出與脂聯素相似的作用。此后，多項研究表明，脂聯素受體激動劑能夠通過激活AMPK信號通路在腎臟、胃腸道、肌肉、心臟等多種組織發揮調控糖脂代謝、抗氧化應激、抗炎癥和抗細胞凋亡作用[53-55]。在肝臟組織，在LPS/D-半乳糖胺(D-Gal)誘導的小鼠急性肝炎模型中，AdipoRon可抑制LPS/D-半乳糖胺暴露小鼠TNF-α的產生，減少肝細胞凋亡，減輕肝損傷，提高存活率[56]。在四氯化碳誘導的小鼠急性肝炎模型中，AdipoRon能顯著降低肝臟MDA、總一氧化氮合酶(tNOS)、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)的水平，抑制促炎和促纖維化細胞因子(TNF-α、TGF-β1、α-SMA、COL1A1)的產生[57]。

除了AdipoRon，也有其他的脂聯素受體激動劑或源自脂聯素的短肽已被開發出來[58-59]，其中，Otvos等[60]設計開發的源自脂聯素的短肽ADP355，在小鼠血清和血液中表現出良好的穩定性，并能顯著降低硫代乙酰胺誘導的肝損傷，抑制肝細胞凋亡，促進受損肝臟細胞的增殖。

4 小 結

肝臟中脂肪酸合成與酯化、脂肪酸轉運、脂肪酸氧化、脂肪分解和利用等代謝途徑的一條或多條發生異常均可導致脂類代謝紊亂，肝細胞中過度積累TG和FFA導致脂肪變性，脂肪酸氧化增加產生過多ROS引起氧化應激和炎癥反應，出現脂肪性肝病。家禽脂肪性肝病多發于肉用仔禽及產蛋禽，導致肝臟脂肪過度沉積，肝功能降低，產蛋率下降，死亡率增高。隨著家禽飼養業集約化養殖的快速發展，引起家禽脂肪性肝病的因素也越來越多。基于脂聯素及其受體激動劑在調控胰島素敏感性、脂類代謝、抗氧化應激和炎癥方面的生物學作用，將來可以通過藥理學、藥物化學、生物化學等多種策略，開發出高效的相關臨床藥物(如脂聯素激動劑等)，提高脂聯素及其在肝臟中受體的表達水平，預防脂肪性肝病的發生或減緩其帶來的危害。