有氧運動通過脂聯素/p38MAPK延緩高脂膳食大鼠肝臟炎癥

徐嘉寶，吳衛東

(鄭州大學體育學院，鄭州 450044)

長期高脂膳食和久坐不動是導致肥胖、脂肪代謝異常、胰島素抵抗及脂質過氧化等多種慢性病高發的重要原因.肝臟是脂肪代謝的主要器官，長期高脂膳食會導致未被氧化的脂質沉積在肝細胞，誘發肝細胞脂肪變性和慢性炎癥.脂聯素是一種主要由脂肪細胞分泌產生的細胞因子，具有改善胰島素抵抗、調節糖脂代謝及抗炎等多種作用，低脂聯素水平會促進肝細胞的壞死和肝纖維化的進程[1].脂聯素受體(AdipoR)包括脂聯素受體1(AdipoR1)和脂聯素受體2(AdipoR2)，AdipoR2主要在肝臟表達.脂聯素與AdipoR2結合后可抑制p38絲裂原激活蛋白激酶(p38MAPK)的表達，而p38MAPK的過度表達是導致炎癥發生、發展的重要因素，還會促進腫瘤壞死因子(TNF-α)表達[1-2].長期有氧運動可增加機體脂肪消耗減少肝臟脂質沉積，也可通過影響不同細胞信號通路發揮抗炎作用，但其具體機制尚不完全清楚.本實驗采用游泳訓練的方法對高脂膳食大鼠進行干預，探討有氧運動延緩高脂膳食大鼠肝臟慢性炎癥發生、發展的分子機制，為應用有氧運動防治長期高脂膳食誘導的肝臟炎癥提供數據支持.

1 材料與方法

1.1 動物和分組

30只6周齡SD雄性大鼠，體質量(170±10) g.適應性飼養1周后將大鼠隨機分為3組(n=10)：基礎飼料對照組(N)、高脂飼料模型組(C)、高脂飼料+運動干預組(E)，均喂養12周.基礎飼料(能量密度為14.32 kJ/g)為國家標準嚙齒類動物飼料，高脂飼料(能量密度為19.8 kJ/g)為基礎飼料基礎上添加質量分數分別為2%膽固醇，10%豬油，5%蔗糖，0.5%膽酸鈉，0.2%丙硫氧嘧啶.

1.2 運動方案

E組大鼠在每周一至周五上午進行無負重游泳訓練，周六、日休息，持續訓練1～2周，水溫控制在(32±2) ℃.大鼠第1天游泳30 min，后每天遞增10 min，遞增到50 min后維持到第1周末，第2周每天游泳60 min，第3周每天游泳70 min，第4周每天游泳80 min，第5周后每天游泳90 min，直到實驗結束[3].

1.3 取材與指標檢測

第12周末游泳訓練結束后48 h，所有大鼠處死取材，取材前禁食12 h.血清指標測定：雙抗夾心酶聯免疫(ABC-ELISA)方法測定血清脂聯素含量，全自動生化分析儀測定血清總膽固醇(Total Cholesterol，TC)、甘油三酯(Triglyceride，TG)、自由脂肪酸(Free fatty acid，FFA)、谷草轉氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)和谷丙轉氨酶(Alanine aminotransferase，ALT).肝組織病理學檢測：大鼠肝組織采用體積分數4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，肝組織連續切片，厚度5 μm.蘇木精-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察肝組織病理學改變，并參考文獻[4]進行炎癥活動度評分.

肝組織AdipoR2,p38MAPK及TNF-α蛋白測定：Western blot方法測定蛋白水平，取肝組織50 mg勻漿，勻漿后4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取上清液.標定蛋白濃度上樣，利用質量分數為15%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，將目的蛋白轉置于封閉緩沖液(質量分數為5%的脫脂奶粉)封閉，Tris緩沖鹽溶液-Tween20(TBST)5 min沖洗1次，共沖洗3次，然后加一抗(V一抗∶V封閉流=1∶1 000)4 ℃封閉過夜.次日早上用TBST沖洗，每次10 min，共沖洗3次，加堿性磷酸酶標記的二抗孵育，NBT/BCIP顯色，采用Quantity One圖像分析軟件對各條帶的灰度值進行分析.以蛋白的灰度值和β-Actin的比值表示該蛋白表達水平.

1.4 統計學分析

所有實驗數據以均數±標準差表示，統計處理采用SPSS13.0統計軟件進行分析.同一指標不同組間采用單因素方差(one-way ANOVA)分析，P<0.05表示有顯著性差異，P<0.01表示有非常顯著性差異.

2 結 果

2.1 大鼠體質量、肝臟濕質量和攝入總熱量

與N組比較，C組大鼠體質量、肝臟濕質量及攝入總熱量均顯著升高(P<0.01).與C組比較，E組大鼠攝入總熱量無顯著性變化，但E組大鼠體質量及肝臟濕質量顯著降低(P<0.01)(表1).

表1 大鼠體質量、肝臟濕質量和攝入總熱量比較

2.2 大鼠肝功能及血脂檢測

與N組比較，C組大鼠血清FFA,TC,TG,ALT,AST水平均顯著升高(P<0.01).與C組比較，E組大鼠血清FFA,TC,TG,ALT,AST水平均顯著降低(P<0.01)(表2).

表2 大鼠肝功能及血脂比較

2.3 肝組織病理學觀察

HE染色結果顯示，N組大鼠肝組織學特征、細胞形態均正常，肝細胞索排列整齊，肝竇正常，肝細胞核結構正常，胞質豐富，無明顯病變.C組大鼠肝組織可見脂肪彌漫性變性，肝索排列紊亂，肝板排列不整齊，肝細胞腫脹，胞質內出現大量空泡，炎癥細胞浸潤肝小葉、匯管區.E組大鼠肝組織病變較C組有所延緩，肝組織形態基本保持正常，肝細胞脂肪變性及肝小葉內、匯管區炎癥均有不同程度減輕(圖1).與N組比較，C組大鼠肝臟炎癥活動度評分顯著增加(P<0.01).與C組比較，E組大鼠肝臟炎癥活動度評分顯著降低(P<0.01)(表3).

表3 大鼠肝臟炎癥活動度評分

2.4 血清脂聯素水平和肝組織AdipoR2,p38MAPK及TNF-α蛋白表達

與N組比較，C組大鼠血清脂聯素水平顯著降低(P<0.01)，肝組織AdipoR2表達降低，p38MAPK,TNF-α蛋白表達水平顯著升高(P<0.01).與C組比較，E組大鼠血清脂聯素水平顯著升高(P<0.01)，肝組織AdipoR2表達增加，p38MAPK,TNF-α蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)(表4、圖2).

表4 血清脂聯素和肝臟AdipoR2,p38MAPK,TNF-α蛋白表達變化

3 討 論

長期慢性炎癥是非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)發生、發展的一個重要原因，非酒精性脂肪肝是一種以慢性彌漫性大泡型肝細胞脂肪變和脂質蓄積為主的代謝綜合征[5-6]，大量研究認為其主要與脂質代謝異常、胰島素抵抗、游離脂肪酸增多等多種因素有關[7].機體脂質代謝處于動態平衡，該平衡一旦被打破，出現脂質代謝異常，脂質異位沉積于肝臟而導致肝臟長期慢性炎癥.本研究發現大鼠經過12周高脂膳食喂養，體質量和肝質量均呈現增加趨勢，提示長期高脂膳食的攝入導致機體脂肪儲存及肝臟脂質蓄積增多.同時高脂膳食組大鼠血清脂聯素水平降低，血清TC,TG,FFA顯著升高，肝臟炎癥活動度評分增加，提示長期高脂膳食導致了大鼠血清脂聯素和血脂水平異常，誘發了大鼠肝臟炎癥.有氧運動可提升大鼠血清脂聯素水平，降低血清TC,TG,FFA含量，有效延緩高脂膳食大鼠肝臟炎癥的發生、發展.

研究發現非酒精性脂肪肝患者血清脂聯素水平顯著低于正常人[8-9]，說明脂聯素與非酒精性脂肪肝的發病密切相關，它可能在由肥胖發展為非酒精性脂肪肝的過程中發揮著重要作用.脂聯素一方面可增強脂肪酸轉運、脂肪氧化和能量釋放，降低血液中TG和FFA的濃度[10]，另一方面在改善高脂膳食大鼠肝臟炎癥方面具有重要作用[11].血清ALT,AST是肝細胞損害的金標準，它們的變化與肝臟炎癥程度呈顯著正相關，其水平的降低可以間接反映肝組織炎癥的改善[12].本研究發現，高脂膳食組大鼠肝板排列紊亂，炎癥細胞浸潤肝小葉，匯管區出現炎癥，運動組大鼠肝臟炎癥明顯減輕；同時，運動組大鼠血清ALT,AST的水平顯著低于高脂膳食組大鼠，血清脂聯素水平顯著升高，提示有氧運動顯著改善了大鼠肝功能，血清脂聯素可能發揮了抑制肝臟炎癥的作用.

p38MAPK最初是由小鼠肝臟細胞分離純化出的一個酪氨酸磷酸化蛋白激酶，主要功能是參與炎癥反應、細胞凋亡、細胞分化以及細胞周期等.脂聯素作為脂肪細胞分泌的一種內源性生物活性蛋白質，它可以改善非酒精性脂肪肝患者的血脂紊亂，延緩肝細胞壞死和肝臟纖維化的進程，同時脂聯素還具有抗炎作用.在脂肪細胞中，脂聯素通過激活p38MAPK在胰島素抵抗中發揮著作用[13].雖然在應激反應中p38MAPK信號通路對機體有保護性作用，但p38MAPK的過度激活可能會使致炎因子大量分泌而導致機體的炎癥.本研究發現C組大鼠肝組織p38MAPK蛋白表達及血清ALT,AST水平顯著高于N組，提示p38MAPK在高脂膳食大鼠肝臟炎癥發生、發展過程中發揮了重要作用.p38MAPK的過度表達是導致炎癥發生、發展的重要因素之一，此時它主要的生物學作用是產生和激活促炎因子加重炎癥反應[14].p38MAPK蛋白的過度表達會促進TNF-α蛋白的表達[15]，持續高水平的TNF-α蛋白表達不僅會導致肝組織的長期慢性炎癥，同時還會使肝臟攝取、合成脂質超過其氧化、分解能力，發生肝臟脂肪化，從而加重肝組織脂代謝紊亂，由此提示高脂飲食誘導的大鼠肝臟炎癥可能與p38MAPK的過度激活有關.運動組大鼠肝組織p38MAPK,TNF-α蛋白表達顯著低于高脂膳食組大鼠，同時血清ALT,AST較C組大鼠明顯降低，血清脂聯素水平及肝組織AdipoR2較高脂膳食組大鼠顯著升高，提示有氧運動可能通過提高大鼠血清脂聯素含量及肝組織AdipoR2表達，抑制了肝組織p38MAPK蛋白的過度表達，減少了炎癥細胞因子TNF-α的釋放，最終延緩了肝組織細胞的炎癥損傷.因此p38MAPK可能是有氧運動通過提高血清脂聯素水平延緩非酒精性脂肪肝發生、發展的有效靶點之一.綜上所述，有氧運動可使高脂膳食大鼠血清脂聯素水平升高，增強肝組織AdipoR2表達，抑制p38MAPK,TNF-α蛋白的過度表達，從而改善高脂膳食大鼠的生化指標，延緩肝組織炎癥的發生、發展.