高糖環境對軟骨細胞RANKL/OPG表達的影響

劉培瓏，張言，梁景棋，刁佳宇，劉歡，梁曉軍，張峰，趙宏謀*

(1.西安交通大學附屬紅會醫院足踝外科，陜西 西安 710054；2，陜西省人民醫院心血管內科二病區，陜西 西安 710068；3，西安交通大學公共衛生學院，陜西 西安 710048)

夏科氏骨關節病(charcot osteoarthropathy，CA)是一種周圍神經病變引起的骨關節進行性、破壞性疾病，近年來隨著全球范圍內糖尿病患者的增加和病程延長，糖尿病已經成為了CA的主要病因[1]。CA的發病機制復雜，可能與多個因素有關，包括神經病變、代謝紊亂、使用激素造成的骨質疏松等，確切機制尚不清楚[2]。CA的早期研究主要集中在骨破壞方面，對于CA關節軟骨破壞機制的研究則罕有報道。我們的前期研究發現，CA的透明軟骨呈條索狀排列，軟骨細胞大量減少，同時破骨細胞聚集，軟骨下骨增生且排列紊亂；且軟骨細胞中核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)與骨保護素(osteoprotegerin，OPG)的表達與正常對照組存在顯著差異[3]。但是這種差異是否與糖尿病患者體內高糖環境有關尚不清楚，國內外尚無關于糖濃度與軟骨細胞RANKL/OPG表達情況的研究，因此本研究的目的是觀察不同糖濃度對于正常軟骨細胞RANKL及OPG表達的影響，以期為明確CA的發病機制及臨床防治提供參考。

1 資料與方法

1.1 軟骨組織來源 8例正常軟骨，男性5例，女性3例；年齡29～55歲，平均年齡(41.3±12.6)歲。均來自于因車禍及嚴重外傷需要截肢的患者的脛距關節，術中確認關節軟骨正常。本研究通過醫院倫理委員會審批(批號：201910002)，所有患者均為自愿捐贈，并簽署知情同意書。

1.2 實驗材料與試劑 細胞培養中所需的Dulbecco氏培養基(Dulbecoo's modified eagle medium，DMEM)/無糖培養基、DMEM/F12培養基、DMEM/高糖培養基、胎牛血清、青霉素和鏈霉素雙抗溶液購自美國HyClone公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自美國Sigma公司；RANKL抗體、OPG抗體及β-actin購自美國CST公司；葡萄糖測定試劑盒購自美國Sigma公司；CO2培養箱及酶標儀購自美國Thermo公司。

1.3 軟骨細胞培養及實驗分組 將軟骨樣本切成3～5 mm3的小塊，置于含青霉素(100 U/L)和鏈霉素(100 mg/L)的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution，PBS)中沖洗后，用1 mL 0.25%胰蛋白酶室溫下消化15～20 min后，1 000 r/min離心5 min，吸除上清液后使用PBS洗滌3次。再加0.2% Ⅱ型膠原酶后置于37℃恒溫搖床中消化8～10 h，后加入2 mL培養液終止消化。使用200目過濾網過濾軟骨碎片，濾液1 000 r/min離心10 min，丟棄上清，使用PBS洗滌2次。使用DMEM/無糖培養基和DMEM/高糖培養基(33 mmol/L)按比例配制葡萄糖濃度為5 mmol/L(正常組)、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、33 mmol/L培養基，配制完成后取不同濃度的培養液加入葡萄糖濃度測定試劑盒，然后使用酶標儀測定340 nm吸光值以確定濃度符合實驗要求。將軟骨細胞分為6組，分別使用葡萄糖濃度為5 mmol/L、10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L、33 mmol/L含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中進行培養，每3 d更換1次培養液，帶原代細胞融合率達到85%～90%時進行傳代，傳代細胞用于后續實驗。

1.4 Western blot檢測RANKL/OPG蛋白表達 分別取6組軟骨細胞，用各組含10%胎牛血清的DMEM培養基將細胞濃度調整為1×106/mL的細胞懸浮液，接種到6孔板中，每孔1 mL，每組設置3個復孔。在37℃、5% CO2培養箱中培養48 h后，每孔加入100 μL裂解液，放在冰上裂解30 min后，4℃ 1 000 r/min離心15 min；吸取蛋白上清液，用聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate，BCA)蛋白定量試劑盒檢測提取蛋白的濃度。用超純水將蛋白樣品濃度稀釋為3 μg/mL，按照4∶1比例與溴酚藍上樣緩沖液混合后煮沸5 min。在蛋白凝膠中每泳道加入蛋白樣品20 μL，以電壓120 V電泳，觀察溴酚藍進入分離膠底端時終止電泳。以90 V電壓轉膜90 min后，在室溫下5%脫脂奶粉中封閉90 min。用PBS加Tween 20(PBS plus tween 20，PBST)洗滌3次，每次5 min。加入1∶1 000稀釋的RANKL單克隆抗體、OPG單克隆抗體及β-actin單克隆抗體4℃孵育過夜。次日用PBST洗滌3次，每次5 min，再加入1∶2 000稀釋的二抗(辣根過氧化物標記的IgG)在室溫孵育2 h后，電化學發光(electro-chemi luminescence，ECL)法顯影并于暗室內曝光。采用Image-Pro Plus圖像分析軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin作為內參，計算目的蛋白的相對表達量。實驗重復3次。目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/β-catin灰度值。

1.5 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件對數據進行分析，多組間計量資料的比較采用χ2檢驗，兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

隨著培養液糖濃度的增高，RANKL蛋白與OPG蛋白的表達量均呈逐漸減小趨勢，RANKL蛋白表達量由2 613.8降低至975.6，OPG蛋白表達量由3 377.3降低至140.2(見表1，見圖1～2)，組間比較存在顯著性差異(P<0.01)；各高糖培養組與正常對照組相比，蛋白表達量均顯著減小(P<0.01)。然而，隨著培養液糖濃度的增高，OPG蛋白表達量的減小趨勢更加顯著，因此，RANKL/OPG相對表達量的比值則呈增加趨勢。當培養液糖濃度>15 mmol/L時，RANKL/OPG的比值呈顯著增加趨勢，在20 mmol/L時比值達到最高點，之后隨培養液糖濃度的增加則略有降低(見圖3)。

表1 不同糖濃度干預軟骨細胞后RANKL及OPG表達量

圖1 不同糖濃度培養的軟骨細胞RANKL與OPG蛋白表達的Western-Blot結果

圖2 不同糖濃度培養的軟骨細胞RANKL與OPG蛋白表達灰度結果

圖3 不同糖濃度培養的軟骨細胞RANKL/OPG相對表達量與比值趨勢

3 討 論

足踝部CA一旦出現，進展迅速，破壞嚴重，發病順序常始于關節內部，導致關節軟骨及周圍穩定組織破壞，進而導致關節脫位與關節周圍骨量丟失，治療效果較差。骨性畸形導致相應皮膚壓力增高并產生潰瘍，增加了感染風險[4]。而CA的治療仍局限于出現骨關節破壞后的外科治療，對于現潰瘍者截肢率和死亡率均非常高[5-6]。因此，揭示CA的發病機制，尋找有效且特異的防治措施，對于糖尿病患者早期預防CA的發生與發展有著非常重要的意義。

RANKL/OPG系統是在破骨細胞分化過程中的一個重要信號傳導通路[7]。研究認為RANKL/OPG信號通路在CA的骨質破壞以及骨愈合延遲中發揮重要作用[8]，而前期研究主要關注于RANKL/OPG在外周血的情況，以期尋找到特異性的血清標志物來對CA早期診斷。有研究指出糖尿病CA急性期與糖尿病患者和健康對照組相比，外周血單核細胞中RANKL的表達較低[9]。也有報道糖尿病CA患者外周血中RANKL基因表達與糖尿病患者和正常對照患者無差異[10]。這些結果提示糖尿病CA的發生可能與局部的病變有關。實際上，關節軟骨細胞和關節滑膜細胞也可以合成和分泌RANKL和OPG[11-12]。RANKL/OPG信號通路也參與調控關節軟骨細胞的去分化與凋亡[11]。我們的研究發現，DCA患者軟骨細胞產生的RANKL顯著高于正常對照組，OPG則顯著低于正常對照組[3]。

關節的穩定與正常代謝依靠關節軟骨的完整、軟骨下骨的支撐和關節內環境的穩定。我們的前期研究發現，糖尿病CA患者中關節軟骨與軟骨下骨交接處出現大量的破骨細胞聚集，這可能與軟骨細胞合成和分泌的RANKL/OPG比例失衡有關[3]。RANKL結合核因子κB受體活化因子(receptor activator for nuclear factor-κ B，RANK)后作用于前體破骨細胞，并誘導其向成熟破骨細胞分化，OPG與RANKL存在競爭關系，OPG可以通過與RANK的結合抑制RANKL與RANK的結合[13]。而且OPG還可以抑制破骨細胞自骨膜釋放并削弱破骨細胞的黏附能力，從而抑制破骨細胞的分化、成熟及其生物作用的發揮，是調控破骨細胞功能活動的最后通路[11]。在骨代謝穩定的情況下，OPG與RANKL的分泌和表達保持著動態的平衡以維持成骨和破骨之間的平衡，如果該平衡被打破，RANKL/OPG比率失調，則會造成骨代謝失衡，引起骨質異常增生或者骨質流失。本研究發現隨著培養液糖濃度的升高，軟骨細胞RANKL和OPG的表達都呈下降趨勢，但是OPG的表達下降更為顯著，這便使得RANKL/OPG比率上調，導致破骨細胞被大量激活和聚集，打破軟骨下骨原有的代謝平衡，導致軟骨下骨過度溶解、吸收，進而導致對關節軟骨的支撐作用減弱，引起關節軟骨損傷與關節脫位。這與臨床中觀察到的糖尿病CA的病理特征是相符合的[14]。因此，長期的高糖環境可能是啟動糖尿病CA的關鍵因素之一。

盡管葡萄糖在包括軟骨細胞在內的所有細胞類型的能量代謝中起作用，但高濃度的葡萄糖對細胞代謝可能具有不利影響，因為過多的細胞內葡萄糖濃度會使糖酵解途徑飽和，從而激活參與葡萄糖代謝的其他二級途徑，如多元醇、己糖胺，蛋白激酶C或磷酸戊糖途徑和產生晚期糖基化終產物，所有這些途徑都會誘導氧化應激和炎性因子的產生[15]。Chen等[16]研究發現，高糖可誘導軟骨細胞環氧合酶-2蛋白表達和前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)、白細胞介素(interleukin，IL)-6、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-13的產生。研究指出，糖尿病大鼠軟骨細胞中MMP-8與MMP-9表達降低，Ⅱ型膠原α1和Ⅰ型膠原α1表達下降，而細胞凋亡相關蛋白表達增加[17]。Laiguillon等[18]的研究表明，在體外培養的軟骨細胞中，高糖環境通過增加氧化應激和多元醇通路導致IL-1β誘導的炎癥反應增加，進而促進軟骨損傷。有學者認為可以通過控制血糖來預防糖尿病患者關節軟骨的破壞和骨關節炎等疾病的進展[19]。我們的研究發現，從RANKL蛋白與OPG蛋白的相對表達量分析，兩者均隨著培養液糖濃度的增加而減小，但OPG的表達量減小則更加明顯，當培養液糖濃度超過15 mmol/L時，RANKL/OPG的比率出現嚴重失衡，在20 mmol/L時達到峰值。因此，細胞外周環境中糖濃度超過15 mmol/L可能是誘發RANKL/OPG比率嚴重失調的臨界值。

綜上所述，隨著細胞外糖濃度的增加，RANKL蛋白和OPG蛋白的表達均會下降，OPG的表達則下降更顯著，因此，RANKL/OPG的比率則會升高。另外，在細胞外糖濃度超過15mmol/L時，RANKL/OPG的比率嚴重失衡，這種變化可能是造成糖尿病患者出現CA的重要因素。然而，細胞外糖濃度與RANKL/OPG表達的直接相關性以及其中的作用機制仍有待進一步研究證實。