骨修復緩釋微球的應用進展

馬博，顧勇，陳亮

(蘇州大學附屬第一醫院骨科，江蘇 蘇州 215006)

骨骼是人體的組成器官，具有保護和支持身體的重要功能。一般來說，骨組織具有良好再生能力，可以自我修復并持續進行生理性改建。然而，當機體處于一些較惡劣的狀態時，比如急慢性炎癥、創傷、骨腫瘤，以及一些先天性的疾病時(如發育畸形等)，就很難通過骨骼進行自我修復，造成損傷處長期的疼痛、活動異常、畸形、肌肉萎縮和負重功能喪失。因此，針對骨損傷修復材料的研發一直是熱點[1-2]。目前，一些人工合成的材料如生物陶瓷、生物玻璃、骨水泥等，已經應用于臨床實踐。而從20世紀50年代開始，微球作為一種新的生物材料形式，逐漸引起人們的注意。它是一種體積為幾十到幾百納米之間的微型球體，其常用的組成材料為聚乳酸、殼聚糖等聚合物，以及一些其他的有機或無機材料，如碳酸鈣、二氧化硅等。20世紀到90年代多孔微球被確定適合作為藥物載體、細胞輸送和組織再生的潛在應用材料[3]，由于其體積微小，可以深入到骨骼創傷間隙，同時具備良好的孔隙和可降解性，以及對藥物及生物活性因子等的緩釋作用，大大降低了對新生骨骼修復過程的干擾，現已越來越多地應用于骨損傷修復中。

1 微球的特征

1.1 微球的大小 微球的直徑大小一般為幾十微米到幾百微米之間。Sheikhi等[4]制備的gelma微球，通過改變gelma溶液內相與油相外相流量比和gelma溶液濃度(7%、10%和20%)，獲得直徑為70～115 μm的gelma微球，可以適應不同的需要。Lin等[5]通過改變微球的大小來控制微球中的蔗糖乙酸異丁酸酯的釋放速率，證實了微球大小對其性能的重要性。

1.2 微球的孔隙 多孔微球表面有外孔或核心有內孔，孔徑是決定生物分子吸附和釋放的重要因素?；钚晕镔|可以溶解或分散在微球的表面或核心。多孔材料按孔徑可分為：微孔材料(<2 nm)、介孔材料(2～50 nm)、大孔材料(50～200 nm)和超大孔材料(>200 nm)。與傳統的微球相比，多孔微球具有更出色的藥物吸附和釋放功能、較大的比表面積和較低的密度等特點。Kunliang等[6]以卡拉膠、正己醇和超順磁性納米氧化鐵為原料，制備了一種新型多孔微球，具有出色的鹽酸阿霉素負載量和釋放性能，在癌癥的治療中具有很大的潛力和競爭力。Xi等[7]通過設計一種具有“蓮子莢面狀”的多糖止血微球，微孔內部相互連通，具有快速止血性能。

1.3 微球的緩釋性能 微球體性質穩定，其多孔微觀結構有助于進行藥物裝載和釋放，因此可作為載體負載各種藥物，以實現藥物長期輸送功能，這對于一些需要長期作用的藥物具有較好的實用價值。Luo等[8]采用溶劑熱法合成了多孔TiO2微球，具有多孔的表面形貌和較高的載藥能力，將其添加到復合骨水泥中，實現了藥物(如慶大霉素)的緩控釋性能。Chen等[9]制備了聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA]-硅酸鈣(CaSiO3)-阿司匹林的復合微球支架，對阿司匹林具有優異的緩釋作用，有望作為一種新型成骨材料。

1.4 微球的生物相容性與生物降解性 具有生物活性的微球不僅應具有粒徑小、多孔、流動性好的優點，還應具有良好的生物相容性與生物降解能力，以免對微球的生物應用帶來很大的影響。Bian等[10]通過將GelMA微球共價偶聯活性肽APETx2再進一步攜帶髓核細胞，成功提高了材料的生物相容性，使得髓核細胞在酸性條件下的存活能力增強。Annamalai等[11]通過靜電相互作用，設計出有效摻入生物活性骨形態發生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)的明膠微球，通過響應巨噬細胞介導的骨愈合的炎癥階段來觸發微球降解，控制生長因子進而促進骨再生。Zhao等[12]在高溫下制備了新型的可生物降解、均勻的羧甲基幾丁質微球，在臨床上作為一種新型的可吸收止血材料具有很大的潛力。

2 微球在成骨方面的應用進展

2.1 微球與無機離子的結合應用

2.1.1 鈦離子 隨著對納米材料越來越多地研發，近來許多研究表明納米二氧化鈦(TiO2)可以促進骨髓間充質干細胞的生長與加速其成骨分化，進而提高骨缺損部位的成骨速率和成骨能力[13]。Khoshroo等[14]制備了聚己內酯(polycaprolactone，PCL)/TiO2燒結微球支架，將TiO2納米管引入到PCL支架中，改善了單純PCL支架的力學性能、生物學性能以及骨組織工程應用的理化性能。Wang等[15]通過將二氧化鈦納米粒子結合到聚乳酸-羥基乙酸共聚物微球中，顯著地增強了微球的成骨誘導能力。

2.1.2 鐵離子 鐵離子作為天然骨所包含的微量元素之一，對于骨代謝具有重要作用。已有研究表明，由鐵離子修飾后的TiO2涂層的生物相容性較之前提高，可以更好地提升涂層的成骨效應[16]。Zhang等[17]通過Pickering乳液設計了氫氧化鐵(Fe(OH)3)納米粒子包裹的聚乳酸-羥基乙酸共聚微球，然后燒結成多孔微球支架，將重組人BMP-2通過聚多巴胺涂層固定在支架上。結果表明，在含有納米Fe(OH)3的支架上培養的小鼠骨髓間充質干細胞具有較好的增殖、成骨分化和遷移能力。Guo等[18]利用水熱法合成了磁性介孔碳酸化羥基磷灰石CaCO3/Fe3O4微球，具有更好的藥物緩釋性能，在骨植入給藥方面具有很大的應用潛力。

2.1.3 鋰離子 鋰離子是Wnt經典通路的激活劑，已有關于含有鋰離子的支架可以促進牙骨質再生的研究報道。Li等[19]制備了鋰/納米羥基磷灰石/明膠微球/重組人促紅細胞生成素復合支架，可以通過鋰激活Wnt信號通路和促紅細胞生成素上調缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor 1，HIF-1)/血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)通路，有效提高了骨髓間充質干細胞的成骨作用和血管內皮細胞的血管生成作用，促進了骨缺損的修復。

2.1.4 鎂離子 鎂是體內含量比較豐富的陽離子之一，主要存在于骨骼和骨骼肌中，在體外表現出促進成骨分化的傾向。多項流行病學研究表明，低飲食鎂與骨質疏松癥之間存在一定關聯。同時，研究證明高濃度的鎂離子也會削弱成骨細胞的活性[20]，所以控制體內鎂離子濃度處于適當水平對于骨骼的健康發育至關重要。Lin等[21]設計了由聚乳酸-乙醇酸生物聚合物、海藻酸鹽水凝膠和氧化鎂納米粒子組成的單分散微球給藥系統，通過可調節的表面微孔網絡精確控制Mg2+的釋放，使鎂離子處于合適的濃度，能有效地提高其成骨活性，表明控制Mg2+精確釋放在臨床上應用于原位骨再生具有良好的研究前景。Yuan等[22]構造了一種包含淫羊藿苷和MgO/MgCO3的PLGA微球，實現了Mg2+與淫羊藿苷的共同釋放，起到了促進成骨的作用。

2.1.5 鈣離子 骨骼的負重功能與骨骼的結構和礦物質含量息息相關，而鈣作為骨骼內主要的無機鹽離子，其攝入量的穩定對于骨骼的生長、維持具有重要意義。近年來，關于羥基磷灰石和白鎖石為代表的含鈣生物陶瓷的研究越來越多。Jose等[23]將羥基磷灰石納米粒子和白鎖石納米粒子分別摻入PLGA微球中，通過表面燒結將復合微球轉化為具有足夠機械強度和特定形狀的骨移植材料，將來有望應用于骨移植和組織工程。Daneshmandi等[24]將過氧化鈣(CaO2)封裝于PLGA微球中，證實了CaO2的代謝產物O2、Ca2+以及H2O2的釋放提高了小鼠血管化骨再生的能力。

2.2 微球與天然高分子材料的結合應用

2.2.1 人參 人參化合物是人參或者人參皂苷在哺乳動物體內的代謝產物，具有抗癌、抗氧化、抗糖尿病、抗脂肪細胞、抗炎和保肝特性等多種功能[25]。Guo等[26]就曾將人參皂苷Rg1負載于海藻酸鹽-殼聚糖微球上，促進人骨髓基質細胞(human bone marrow stromal cells，hBMSC)的增殖和分化，抑制缺氧后-復氧誘導的hBMSC凋亡。Thangavelu等[27]通過靜電作用制備了含人參化合物K的雙相磷酸鈣-殼聚糖微球，結果顯示，含有人參化合物K的微球支架有利于成骨細胞樣細胞系(MG63)的附著；并且，微球支架在大鼠骨髓干細胞中的成骨基因表達顯著增強，說明這種新型微球支架系統有望成為新型的骨再生材料。

2.2.2 瓊脂糖 瓊脂糖具有線型結構，有著可逆的熱凝膠行為、出色的機械性能和較高的生物活性，因此，瓊脂糖在構造先進的藥物遞送系統方面受到廣泛關注[28]。Hasan等[29]通過瓊脂糖強化雙相磷酸鈣和雙相硫酸鈣制備了復合微球，并對其用于骨再生，結果表明，這種微球有利于細胞黏附和增殖、對新骨形成具有促進作用，在骨替代應用方面具有巨大的潛力。Annamalai等[30]利用瓊脂糖基質包裹人骨髓間充質干細胞和Ⅱ型膠原蛋白，再采用油包水的方法形成微球，研究證實可以增強人骨髓間充質干細胞的軟骨分化。

2.2.3 柚皮苷 柚皮苷存在于中草藥和柑橘類水果中，具有廣泛的藥理活性，包括抗炎、抗癌活性，以及對骨再生、代謝綜合征、氧化應激、遺傳損傷和中樞神經系統等的生物學作用[31]。Yang等[32]在單分散的柚皮苷微球中加入醋酸異丁酸酯，明顯減少了柚皮苷的突釋，具有良好的生物相容性和體外成骨能力。Guo等[33]將包裹柚皮苷的殼聚糖微球負載到含有小白菊內酯的多孔PLLA支架網絡上，延長了柚皮苷的釋放時間，同時相較于單純的PLLA網絡，進一步提高了支架引導骨再生的能力。

2.2.4 細菌纖維素 細菌纖維素是一種來源于細菌的納米纖維材料，具有高結晶度和聚合度、高表面積、高柔韌性、高吸水能力等，近年來被廣泛開發應用傷口愈合、人造皮膚、硬腦膜假體、動脈支架涂層、軟骨和骨修復植入物等再生醫學領域[34]。Zhang等[35]采用Malaprade反應和Schiff堿反應，構建出了膠原/細菌纖維素復合微球，并且進一步通過反相懸浮法制備負載生長因子BMP-2，構建出了具有多級結構和組成的三維支架多孔微球，具有良好的生物相容性，能有效促進小鼠MC3T3-EL細胞的黏附、增殖和成骨分化，為膠原/細菌纖維素多孔微球在骨組織工程領域的應用提供了理論依據。

2.3 微球與藥物的結合應用

2.3.1 利福噴丁 骨關節結核是一種古老的慢性消耗性疾病，絕大多數是由結核分枝桿菌引起的。利福噴丁是一種半合成的福霉素類抗生素，對潛伏性結核感染具有良好的效果。Wang等[36]制作出了利福噴丁-聚乳酸緩釋微球用以治療骨關節結核，具有使利福噴丁的給藥系統更穩定，緩釋時間更長，良好的生物相容性、骨傳導性和骨誘導性，為臨床治療骨關節結核提供了一種新的治療策略。Liang等[37]設計了一種主體為包含利福噴丁的聚乳酸微球，同時結合了間充質干細胞和羥基磷灰石/磷酸三鈣，組成三維復合支架，可治療感染，促進骨形成。

2.3.2 阿侖膦酸鹽 阿侖膦酸鹽已證明口服可有效治療和預防絕經后的骨質疏松癥、皮質類固醇誘發的骨質疏松癥和佩吉特骨病，其主要作用機制為抑制破骨細胞的骨吸收行為。到目前為止，它已成為治療骨質疏松癥和其他由于骨吸收引起的疾病的主要藥物之一。Wang等[38]開發了一種具有短期控釋特性的聚乳酸交聯阿侖膦酸鈉微球，可以連續9 d釋放50～100 nm的阿侖膦酸鈉。Yang[39]通過一種簡便的方法制備了負載阿侖膦酸鹽的羥基磷灰石微球，將骨髓間充質干細胞與微球共培養，不僅促進了骨髓間充質干細胞的增殖，而且還成功誘導了其成骨分化。這些均表明了這種微球結構能更好地促進阿侖膦酸鹽的合理釋放并發揮其成骨功能。

2.3.3 雷洛昔芬 絕經后的婦女由于缺乏雌激素，常常導致骨質疏松的發生。雷洛昔芬(raloxifene，RLX)是一種選擇性雌激素受體調節劑，對于預防和治療絕經后婦女的骨質疏松癥具有良好的作用[40]。Zhang等[41]通過將負載RLX的PLGA微球接枝到由殼聚糖、膠原和β磷酸三鈣組成的三組分支架，實現了RLX的可控性緩釋。

2.4 微球與生物活性因子的結合應用 BMP-2是轉化生長因子-β超家族的成員，具有促進體內成骨分化和軟骨分化的重要作用，已被廣泛地應用于骨缺損、骨不連和骨質疏松癥等的修復治療中[42]。Gong等[43]制備了BMP-2特異結合位點的CaCO3微球，并進一步將其包裹在纖維蛋白膠水凝膠中，實現了BMP-2持續高達21 d可控釋放，有利于長期的成骨過程。Ji等[44]將載有BMP-2或P24的PLGA微球與殼聚糖、納米羥基磷灰石/膠原蛋白復合，可以很好地緩釋成骨因子來促進成骨，為自體和異體骨移植提供了更多的可能性。

綜上所述，微球具有體積微小、高孔隙率和高載藥率的特點，并具有可觀的生物相容性、可降解性和緩釋性能，近年來被廣泛應用于骨損傷的治療方面。然而，微球復雜的制備過程，不均勻的大小形態，不穩定的結構，以及無法精確控制藥物釋放和自身代謝時間用以配合骨骼修復過程等一系列問題，仍然需要進一步的深入研究?？傮w來看，微球作為治療骨損傷的一種材料結構，在之后的臨床治療方面具有很大的應用潛力。