黃芪多糖對慢性心力衰竭大鼠心肌細胞能量代謝的影響

劉莉莉，王國良

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是各種心臟疾病發展的終末階段，5年生存率與惡性腫瘤相似，且隨著我國人口老齡化的加劇，CHF發病率呈逐年上升趨勢，增加家庭及社會負擔[1]。目前CHF的藥物治療以醛固酮拮抗劑、β-受體阻滯劑、血管緊張素轉換酶抑制劑等神經內分泌抑制劑為主，盡管可取得一定臨床療效，但該病致殘率及病死率仍居高不下[2-3]。研究發現，心力衰竭時心室擴大及功能異常的病理學機制可能與心肌能量代謝障礙有關，成為CHF治療的新思路[4]。黃芪多糖(astragalus polysaccharides，APS)提取自補氣中藥黃芪，具有抗炎、抗氧化、增強免疫能力、降血糖、抗腫瘤等多種藥理學活性[5]。近年來，有研究將APS用于糖尿病性心臟病的治療，效果滿意，且可改善膿毒癥大鼠心臟功能，證明其在心臟系統疾病治療中的作用[6-7]。然而，目前鮮有關于APS對CHF心肌細胞能量代謝的影響及相關機制的研究。鑒于此，本研究通過建立CHF模型大鼠，研究APS對其心肌細胞能量代謝的影響，并探討相關機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠，6周齡，體質量(200±20)g，來自華北制藥股份有限公司[許可證號：SYXK(冀)2019-011]。飼養條件：溫度22～26 ℃，濕度40%～60%，正常飲食、飲水。

1.2 藥物、主要試劑和儀器 三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司)，凋亡細胞原位末端轉移酶標記法(TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(上海通蔚生物科技有限公司)，5-單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)和過氧化物酶體增殖物激活受體共激活因子-1(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1，PGC-1α)單抗(美國Thermo Fisher Scientific公司)，APS(西安明澤生物科技有限公司)，AMPK抑制劑Compound C(美國Apexbio公司)，卡托普利(四川太平洋藥業有限責任公司)，VEVO3100小動物超聲成像系統(加拿大VisualSonics公司)，1200高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，H-9500透射電鏡(日本株式會社日立制作所)，SM2010R徠卡切片機(德國徠卡顯微系統貿易有限公司)；IX71-F22FL/PH顯微鏡(日本Olympus株式會社)；1658001 Mini-PROTEAN小型蛋白垂直電泳槽、ChemiDoc XRS化學發光成像分析系統(美國Bio-Rad公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 模型建立及分組 參照文獻[8]采用腹主動脈縮窄法建立大鼠CHF模型。取60只SD大鼠，用2%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰臥位，用大鼠固定器固定，腹部常規剃毛、消毒，劍突下1 cm位置縱向切口，長度約2 cm，分離腎動脈上方腹主動脈，長度約1 cm。10只大鼠僅進行以上手術操作，不結扎腹主動脈，設為對照組。其余50只大鼠采用7號針頭平行于腹主動脈放置，針頭與腹主動脈一起結扎，結扎后抽出7號針頭，抽針時以感覺到箍筋感為宜，使腹主動脈部分狹窄60%～70%。術后所有大鼠腹腔注射青霉素，每只2×105U/d，連續3 d。腹主動脈結扎后8周，如大鼠出現勞力性呼吸困難、呼吸急促、心動過速等失代償性癥狀，且經小動物超聲成像系統檢查左室射血分數(left ventricle ejection fraction，LVEF)<50%，則提示建模成功。將建模成功的41只大鼠隨機分為CHF組(10只)、挽回組(10只)、APS組(10只)、陽性藥物組(11只)。

1.3.2 干預方式 APS組采用APS干預，結合前期實驗研究結果及相關文獻確定APS使用劑量為400 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水中灌胃給藥，每天1次，藥物干預后再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復采用生理鹽水2 mL灌胃1次[9]；挽回組采用APS+AMPK抑制劑Compound C干預，400 mg/kg APS灌胃給藥，每天1次，Compound C水溶液2 mL(濃度10 μmol/L)灌胃，8 h后重復采用Compound C水溶液2 mL灌胃1次；陽性藥物組采用卡托普利干預，卡托普利劑量為10 mg/kg，溶于5 mL生理鹽水灌胃給藥，每天1次，再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復采用生理鹽水2 mL灌胃1次[10]；對照組與CHF組先給予5 mL生理鹽水灌胃，每天1次，再采用生理鹽水2 mL灌胃，8 h后重復采用生理鹽水2 mL灌胃1次。連續干預28 d。

1.3.3 超聲心動圖測定心功能指標 末次干預后4 h固定大鼠，采用超聲心動儀測定心功能指標：LVEF、左室舒張末期內徑(left ventricular end diastolic diameter，LVEDD)、左室收縮末期內徑(left ventricular end systolic diameter，LVESD)、左心室短軸縮短率(left ventricular fraction shortening，LVFS)。

1.3.4 組織取材方式 心功能指標測定完成后脫頸處死大鼠，迅速分離其心臟，用生理鹽水沖洗干凈心臟表面血液，去除周圍脂肪，濾紙吸干，沿房室溝減掉兩心房、肺動脈、主動脈，緊貼室間隔右側將右心室壁游離，剩余組織即為左心室。順左心室中部橫軸，取0.5 cm左右厚的左心室心肌組織用于測定ATP含量、觀察心肌細胞線粒體結構、蘇木精-伊紅(HE)染色、TUNEL染色，剩余左心室組織保存于液氮中用于蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗。

1.3.5 測定心肌ATP含量 取左心室心肌組織，勻漿后12 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，取上清。以每孔50 μL置于96孔酶標板中，按照ATP試劑盒說明書要求采用高效液相色譜儀檢測。采用考馬斯亮藍法(Bradford)測定樣本總蛋白濃度，換算為nmol/mg·prot形式表示。

1.3.6 透射電鏡觀察心肌細胞線粒體結構 取左心室心肌組織，用4%戊二醛磷酸緩沖液固定30 min后，制成1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm組織塊，4 ℃固定，脫水、浸透、包埋、染色，制作成超薄切片，厚度50～70 nm，透射電鏡下觀察心肌細胞線粒體結構。

1.3.7 HE染色觀察心肌組織病理變化 取左心室組織，采用40%多聚甲醛固定，流水沖洗30 min后乙醇脫水、二甲苯透明、浸潤石蠟制作成蠟塊，以病理切片機制作成5 μm連續切片，脫蠟后采用HE染色，顯微鏡下觀察梗死區心肌組織病理變化。

1.3.8 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡 取左心室心肌組織切片，用40%中性甲醛固定，脫水并包埋后采用病理切片機制作成連續切片，厚度4 μm，嚴格根據TUNEL細胞凋亡原位檢測試劑盒操作要求進行，加入TUNEL反應混合液，于37 ℃濕盒中孵育，時間60 s，用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)充分沖洗，加入植物過氧化物酶(POD)轉化劑，同條件繼續孵育30 s，PBS充分沖洗，加入辣根過氧化物酶顯色底物(DAB)溶液，常溫孵育3 s，PBS溶液充分沖洗，蘇木精復染，常規脫水后采用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察心肌細胞凋亡情況。細胞核被染成不同程度棕黃色為凋亡細胞，凋亡率=陽性細胞數/細胞總數×100%。每張切片任選5個視野計數，求平均值。

1.3.9 Western Blot法檢測心肌組織磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、AMPK、PGC-1α蛋白相對表達量 取液氮保存的心肌組織40 mg，研磨充分后轉至離心管中，經裂解液冰上裂解30 min，用12 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，取30 μg待檢測樣本混合等體積上樣緩沖液，沸水浴5 min，用12 000 r/min離心20 min(離心半徑8 cm)，取上清，12% SDS-PAGE分離，電轉儀將條帶轉移至硝酸纖維素膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加入兔抗大鼠一抗稀釋液[p-AMPK、AMPK、PGC-1α單抗(1∶1 000)]，4 ℃搖床孵育過夜，Tris緩沖生理鹽水(TBST)洗滌，加入山羊抗兔IgG二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌。暗室顯影，凝膠成像系統掃描分析條帶灰度值，以p-AMPK、AMPK、PGC-1α與內參β-actin條帶灰度值比值表示蛋白相對表達量。

2 結 果

2.1 各組心功能指標比較 各組LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽性藥物組LVEF、LVFS均降低，LVEDD、LVESD均增加，差異有統計學意義(P<0.05)；與CHF組比較，挽回組、APS組、陽性藥物組LVEF、LVFS均升高，LVEDD、LVESD均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽性藥物組LVEF、LVFS均升高，LVEDD、LVESD均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；APS組、陽性藥物組LVEF、LVEDD、LVESD、LVFS比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組心功能指標比較 (±s)

2.2 各組心肌組織ATP含量比較 各組心肌組織ATP含量比較，差異有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽性藥物組心肌組織ATP含量均降低，差異有統計學意義(P<0.05)；與CHF比較，挽回組、APS組、陽性藥物組心肌組織ATP含量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽性藥物組心肌組織ATP含量均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；APS組、陽性藥物組心肌組織ATP含量比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表2。

表2 各組心肌組織ATP 含量比較(±s) 單位：nmol/mg·prot

2.3 心肌細胞線粒體結構 對照組心肌細胞線粒體結構正常，排列整齊，大小均勻；CHF組心肌細胞線粒體排列紊亂、大小不一、數量減少，可觀察到明顯空泡變性，腫脹線粒體嵴減少，大部分發生斷裂，心肌細胞橫紋、潤盤模糊，間質中纖維結構數量增加，部分區域纖維溶解、斷裂；挽回組、APS組、陽性藥物組線粒體排列與大小變規則，數量逐漸增加，空泡變性及腫脹減輕，線粒體嵴增加，心肌橫紋、潤盤變清晰。3個干預組中陽性藥物組改善最為明顯，其次為APS組，最后為挽回組。詳見圖1。

圖1 透射電鏡觀察心肌細胞線粒體結構(×20 000，標尺20 μm)

2.4 心肌組織病理變化 對照組心肌細胞排列致密、整齊，心肌橫紋清晰；CHF組可觀察到心肌細胞發生明顯的變性及壞死，部分細胞核溶解、碎裂，部分心肌纖維變性、溶解、斷裂，心肌橫紋模糊或消失；挽回組、APS組、陽性藥物組心肌細胞形態結構損傷有所減輕，心肌橫紋較為清晰。3個干預組中陽性藥物組改善最為明顯，其次為APS組，最后為挽回組。詳見圖2。

圖2 HE染色觀察大鼠心肌細胞形態(×200，標尺100 μm)

2.5 各組心肌細胞凋亡情況比較 對照組、CHF組、挽回組、APS組、陽性藥物組心肌細胞凋亡率分別為(3.57±0.46)%、(63.20±7.41)%、(31.97±4.58)%、(20.58±3.02)%、(12.54±1.57)%，各組凋亡率比較，差異有統計學意義(F=308.589，P<0.001)。與對照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽性藥物組心肌細胞凋亡率均升高，差異均有統計學意義(P<0.001)；與CHF組比較，挽回組、APS組、陽性藥物組心肌細胞凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；與挽回組比較，APS組、陽性藥物組心肌細胞凋亡率均降低，差異均有統計學意義(P<0.001)；與APS組比較，陽性藥物組心肌細胞凋亡率降低，差異有統計學意義(P<0.001)。詳見圖3。

圖3 TUNEL染色觀察心肌細胞凋亡情況(×400，標尺50 μm)

2.6 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較，差異均有統計學意義(P<0.05)；與對照組比較，CHF組、挽回組、APS組、陽性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均降低，差異均有統計學意義(P<0.05)；與CHF比較，挽回組、APS組、陽性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；與挽回組比較，APS組、陽性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK均升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；APS組、陽性藥物組PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較，差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表3、圖4。

表3 各組心肌組織PGC-1α蛋白、p-AMPK/AMPK比較 (±s)

圖4 心肌組織p-AMPK、AMPK、PGC-1α 蛋白表達條帶圖

3 討 論

CHF是指心臟功能或結構異常導致心室射血能力或心室充盈受損而引發的一組臨床綜合征，以肺循環、體循環淤血及組織血液灌注不足為主要病理表現，最終導致心臟泵血功能降低[11]。研究顯示，神經內分泌細胞因子過度激活導致的心室重構是CHF發展的基礎[12]。心室重構是一種極為復雜的過程，與心肌細胞肥厚、凋亡、能量代謝、細胞外基質沉積、基因表達異常、多種基因相互作用等一系列分子、細胞機制關系密切，從而導致心肌表型、結構、功能改變[13]。隨著CHF治療從短期逆轉血流動力學轉變為長期、修復性策略，心室重構及心肌細胞能量代謝逐漸成為研究熱點，有望為CHF治療提供新策略。心肌收縮與舒張都需要足夠能量供應，ATP是心肌組織唯一可直接使用的能源，經能量代謝途徑存儲在葡萄糖與脂肪酸中。心力衰竭時，ATP供應不足，導致心肌收縮-耦聯障礙及收縮、舒張功能異常，從而誘發心力衰竭與能量代謝重構[14]。此外，心肌細胞凋亡在CHF中發揮重要作用，過度凋亡將導致心肌細胞數量不足，心肌收縮功能降低，引發CHF進行性惡化。本研究中，與CHF組比較，APS組LVEF、LVFS升高，LVEDD、LVESD降低，心肌組織ATP含量較高，心肌細胞線粒體結構、心肌組織病理變化較輕，心肌細胞凋亡率較低，提示APS可改善CHF大鼠心功能，改善心肌細胞能量代謝、心肌細胞線粒體結構破壞、心肌組織病理變化，減少心肌細胞凋亡。APS是中藥黃芪的主要活性成分之一，除抗衰老、抗病毒、降血糖、調節免疫力、抗腫瘤等藥理作用外，還具有抗血管內皮損傷、抗心律失常、抗心肌重塑及抗心肌缺血的功效，提示其可用于心血管疾病治療[15]。陳彥等[16]研究顯示，黃芪及其組分可保護心肌線粒體結構，激活生物氧化相關酶，調節肌酸激酶表達，從而發揮改善心肌能量代謝、延長心力衰竭進展的作用，本研究結果與其部分相似，提示APS在改善CHF心肌細胞能量代謝、減輕心室重構方面的優勢。

AMPK/PGC-1α信號通路是新發現的缺血缺氧、能量代謝調節相關通路。AMPK是一種異源性三聚體結構，其催化亞基α亞基上第172位蘇氨酸磷酸化后可激活AMPK，通過影響細胞物質代謝途徑促進脂肪酸氧化及ATP生成，以維持細胞能量平衡，因此AMPK作為“能量調節器”及“細胞內燃料機”備受關注。PGC-1α是重要的能量代謝輔助調節因子，其作為AMPK下游效應分子，可被AMPK直接激活，通過促進線粒體生物合成控制心肌能量動態平衡。Quan等[17]研究發現，AMPK/PGC-1α信號通路與心肌缺血性損傷密切相關，心肌梗死后該通路表達水平明顯下調，導致線粒體功能異常，心肌能量供應不足。既往動物實驗發現，采用中草藥混合物調節AMPK相關的葡萄糖代謝途徑增加肝臟和肌肉中琥珀酸脫氫酶、蘋果酸脫氫酶含量來改善糖原的儲存[18]。本研究結果顯示，CHF組、挽回組、APS組LVEF、LVFS依次升高，LVEDD、LVESD依次降低，心肌組織ATP含量依次升高，心肌細胞線粒體結構、心肌組織病理變化依次減輕，心肌細胞凋亡率依次降低，p-AMPK/AMPK、PGC-1α蛋白相對表達量依次升高，提示APS對CHF大鼠的治療作用可能與激活AMPK/PGC-1α信號通路有關。

綜上所述，APS可改善CHF大鼠心功能及心肌細胞能量代謝，減輕心肌細胞線粒體結構破壞及心肌組織病理變化，減少心肌細胞凋亡，推測其作用機制與激活AMPK/PGC-1α信號通路有關。