膠質母細胞瘤病人SOX21基因與預后的關系

盧 玲，黃其柳，黃小妹，呂婷婷，何乾超，梁 妮，刁麗梅

膠質母細胞瘤又叫多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)，是最常見和最具侵襲性的原發性腦瘤，中位生存時間只有15個月[1]。盡管采用手術、放療、化療等治療策略病人生存時間有所改善，但預后仍較差，5年死亡率大于90%[2]。隨著轉錄組學研究的進展，對膠質母細胞瘤的潛在分子機制的認識不斷提高，且提出了不同的臨床見解和治療決策。目前，分子治療仍被認為是膠質母細胞瘤治療的重要突破口之一。多種mRNA分子標記已被證實在膠質母細胞瘤中發揮重要作用，包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、酪氨酸激酶受體2(v-erb-b2 erythroblastic leukemia viral oncogene homolog，ERBB2)和異檸檬酸脫氫酶1(IDH1)等[3-6]。因此，通過挖掘膠質母細胞瘤發病的潛在分子機制，識別潛在的分子生物標記物，可對膠質母細胞瘤進行早期的診斷、預防和個性化治療。SOX基因是一組編碼轉錄因子的發育調控基因，在人和小鼠中有20個SOX相關基因的表達[7]。早期的研究已經證實，SOX基因參與了許多發育過程，如性別決定和分化、神經發生、軟骨發生和胸腺細胞分化[8]。近期研究還發現，SOX基因的突變和異常表達與多種腫瘤的發生發展有關[9-11]。既往研究發現，SOX2表面蛋白在正常胃黏膜中表達，但在部分人胃癌組織中表達下調，SOX2通過影響細胞周期阻滯和凋亡，在抑制胃上皮細胞的生長中發揮了關鍵作用[12]。在小細胞肺癌病人血清中也檢測到SOX(SOX1、SOX2、SOX3、SOX21)基因表達上調[13]。此外，SOX家族抗體(包括SOX1、SOX2、SOX3、SOX21)在區分小細胞肺癌(SCLC)、Lambert-Eaton肌無力綜合征(LEMS)和非腫瘤LEMS中具有診斷價值[14]。SOX21基因在小細胞肺癌中的作用已被研究證實。且有研究報道，SOX21可以通過抑制SOX2在膠質瘤細胞系中誘導膠質瘤細胞凋亡[19]。但是，SOX21與膠質瘤病人的臨床病理特征的關系及預后作用尚未見報道。

本研究基于癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas，TCGA)探討SOX21基因與膠質母細胞瘤臨床特征的相關性，分析SOX21在膠質母細胞瘤中的預后作用。通過分析TCGA數據庫中SOX21基因在膠質母細胞瘤和非腫瘤組織中的表達值，并通過單因素和多因素COX分析確定了SOX21在膠質母細胞瘤病人中的預后價值。同時，通過基因集富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)檢測了SOX21與GBM相關的生物學途徑。

1 資料與方法

1.1 轉錄組測序數據的獲取 從癌癥基因組圖譜數據庫(TCGA，https：//portal.gdc.cancer.gov)中獲取了膠質母細胞瘤隊列(Project Id is TCGA-LUAD and Workflow Type is HTSeq-FPKM and Data Category is Transcriptome Profiling and Data Type is Gene Expression Quantification)的174個轉錄組測序樣本數據，并從TCGA數據庫下載病人對應的臨床病理信息。

1.2 基因集富集分析 本研究采用基因集富集分析，探討SOX21高表達組和低表達組存在顯著差異的可能性。基因富集分析的標準：GSEA 中|NES|>1、NOM p-val<0.05和FDR q-val<0.25的富集結果被認為差異有統計學意義，為顯著富集[15-16]。

1.3 統計學處理 采用Wilcoxon非參數檢驗比較多形性膠質母細胞瘤與非腫瘤組織的基因表達水平差異情況。根據SOX21基因表達的中位值作為截斷閾值，將多形性膠質母細胞瘤病人分為高、低表達兩組。采用Wilcoxon符號秩次檢驗或Kruskal檢驗以及Logistic回歸來評估SOX21與其他臨床特征的關系。采用單變量COX回歸分析多形性膠質母細胞瘤病人的臨床病理特征與總生存時間的相關性。采用多變量COX回歸分析確定SOX21基因是否獨立于其他臨床病理特征。所有的統計分析均使用R語言軟件(v.3.5.1)操作完成。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 樣本納入情況及多形性膠質母細胞瘤的基線資料 TCGA數據庫中共有膠質母細胞瘤樣本174例，其中腫瘤樣本169例，非腫瘤樣本5例，剔除了生存時間和生存狀態不完整的5個膠質母細胞瘤樣本。最終，本研究納入了159例膠質母細胞瘤病人樣本。159例膠質母細胞瘤病人的臨床病理資料。詳見表1。

表1 TCGA膠質母細胞瘤病人隊列的臨床病理特征 單位：例(%)

2.2 SOX21在膠質母細胞瘤組織和非腫瘤組織中表達情況 通過 Wilcoxon 符號秩檢驗比較SOX21在膠質母細胞瘤腫瘤組織和非腫瘤組織中的表達，本研究發現SOX21在腫瘤組織中高表達(P=0.004)。詳見圖1。

圖1 SOX21基因在膠質母細胞瘤腫瘤組織和非腫瘤組織中的表達量

2.3 SOX21表達與膠質母細胞瘤臨床特征的關系 通過Kruskal檢驗和Wilcox檢驗比較SOX21表達與不同臨床特征的關系(見圖2)。使用Logistic回歸分析SOX21基因與不同臨床病理特征的關系(見表2)。結果表明，TCGA亞型與SOX21表達相關(P<0.001)。與經典型比較，間質型、神經元型和前神經元型的差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2 SOX21基因表達與膠質母細胞瘤不同臨床病理特征的關系圖(A為SOX21基因表達與TCGA亞型的關系；B為SOX21基因表達與年齡的關系；C為SOX21基因表達與性別的關系；D為SOX21基因表達疾病新事件類型的關系；E為SOX21基因表達與KPS生活質量評分的關系)

表2 Logistic回歸分析SOX21基因與不同臨床病理特征的關系

2.4 生存結果和COX分析 以SOX21的中位表達值為截斷點的Kaplan-Meier曲線顯示，SOX21高表達與較好的總生存率相關，而SOX21低表達與較差的總生存率相關(P=0.006)。單因素COX分析表明，SOX21的高表達與更好的OS相關[HR=0.69；95%CI(0.54，0.88)，P=0.01)]。多變量COX分析中，SOX21仍與OS保持獨立關系，HR=0.70，95%CI(0.55，0.90)，P=0.01。詳見表3、圖3。

表3 單因素及多因素COX回歸分析

圖3 SOX21基因高低表達組的生存曲線圖

2.5 基于基因集富集分析的SOX21相關信號通路 將 159例癌組織樣本按 SOX21 表達量中位值分為高表達和低表達兩個表型進行基因富集分析。本研究分析了SOX21高表達組和SO21低表達組兩個表型之間的膠質母細胞瘤相關的信號通路。根據標準富集評分(normalized enrichment score，NES)選擇富集最顯著的信號通路，結果顯示，在SOX21高表達表型中，丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、過氧化物酶體和賴氨酸降解顯著富集。詳見表4、圖4。

表4 SOX21基因高表達表型的GSEA最顯著富集通路的參數值

圖4 SOX21基因高表達表型的GSEA最顯著富集通路結果圖

3 討 論

本研究結果表明，SOX21的低表達與多形性膠質母細胞瘤病人較差的生存狀態有關。總生存時間的生存曲線也顯示，SOX21低表達與膠質母細胞瘤病人的不良預后相關。單因素和多因素COX分析顯示，SOX21的表達可能是膠質母細胞瘤預后的一個獨立的預后因素。

已有研究證明，SOX21在脊椎動物神經發生過程中起著舉足輕重的作用，SOX21通過調節自身表達與SOX1-3活性之間的平衡，決定神經細胞是保持在祖細胞狀態，還是向神經元分化[17]。體外實驗表明，SOX21表達上調或添加siRNA對抗SOX2，可以抑制膠質瘤細胞中SOX2的表達，而SOX2的表達下調可誘導凋亡導致細胞增殖下降[18]。此外，在人膠質瘤細胞中誘導SOX21的表達可以抑制腫瘤生長，延長異種移植小鼠的生存期，SOX21降低了腫瘤細胞的干細胞樣特性，導致腫瘤細胞分化異常、凋亡增多、增殖減少[19]。這些證據表明，轉錄因子SOX21作為抑癌基因在膠質瘤的發生發展中發揮著關鍵作用，它可能是潛在的生物標志物，且膠質瘤的診斷和治療中發揮關鍵作用。

本研究的結果表明，SOX21在膠質母細胞瘤病人中的表達降低與膠質母細胞瘤分子亞型相關，并預示著不良預后。富集途徑主要有丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸降解、過氧化物酶體和賴氨酸降解。美國NIH項目的研究資料提示丙酸代謝可能與乳腺癌轉移有關，作為支鏈氨基酸(BCAAs)的亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸在腫瘤中優先被攝取以合成蛋白質或通過腫瘤氧化獲得能量[20]。此外，BCAA代謝酶如細胞醇支鏈轉氨酶1(cytosol branch-chain aminotransferase 1，BCAT1)在膠質瘤細胞系中有抑制BCAT1的作用，在體外可以阻斷谷氨酸排泄，降低細胞增殖和侵襲性，并顯著降低移植瘤模型的腫瘤生長[21]。過氧化物酶體的生物學發生、酶功能和自噬降解已經被文獻報道與腫瘤的發生有關[22]。GSEA富集分析結果揭示了SOX21基因在膠質母細胞瘤中的潛在通路，為進一步深入研究提供了一定的參考。

綜上所述，SOX21的表達上調可能是膠質母細胞瘤病人良好生存的潛在預后分子標記。此外，丙酸代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、過氧化物酶體和賴氨酸的降解可能是SOX21在GBM中調控的關鍵信號通路。但SOX21基因如何通過這些潛在的代謝通路對膠質母細胞瘤的疾病進展和預后發揮作用仍有待進一步的實驗驗證。同時，需要在分子生物學水平和蛋白水平進行更多的實驗，對SOX21基因的功能進行深入研究。