早期肥胖大鼠與早期糖尿病大鼠空腸病變比較研究*

耿旭芳 王 嫚 祗明花 王亞文 段曉峰 侯聰聰 李 麗 趙 丁

河北醫科大學藥學院，河北省石家莊市 050017

糖尿病和肥胖等代謝性疾病發病率日益增加，已成為全球性的公共衛生問題。胃腸道有可能是代謝性疾病的發源地，由于糖尿病和肥胖患者胃腸病變的發病率極高，普遍伴隨腹瀉、便秘、腹痛和大便失禁等癥狀[1-2]，可能會引起腸道結構及功能的變化[3-4]。由于腸道的復雜性，尤其是各種不同類型代謝性疾病的腸道病變研究甚少，導致臨床治療的針對性不足，甚至被忽視。

腸道不僅是機體消化、吸收營養物質的主要場所，也是機體重要的防御屏障。其屏障能夠有效地防止腸內細菌、毒素等有害物質進入機體，而腸黏膜屏障在其中發揮著關鍵作用。有研究表明，肥胖和糖尿病引起的腸道病變與腸黏膜屏障的完整性喪失、腸道的通透性發生變化有密切關系，從而導致有害物質直接進入組織器官甚至循環系統，對機體造成嚴重損害[5]。近年來，眾多學者倡導疾病的早期發現、早期治療及早期預防的新思路，對于糖尿病的防治具有重大意義。因此，研究早期2型糖尿病(T2DM)、早期1型糖尿病(T1DM)及早期飲食引起的肥胖大鼠空腸病變的差異，可為相關代謝疾病引發腸道病變的機制提供研究思路，并可為肥胖、T2DM、T1DM腸道病變的早期干預提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)實驗動物及分組：實驗動物采用SPF級SD雄性大鼠，鼠齡5～6周，40只，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：CXK(冀)2013—1003。動物于IVC型獨立送風隔離籠具進行分籠飼養。大鼠適應性喂養后，隨機分為對照組、早期肥胖組、早期T2DM組、早期T1DM組，各10只。(2)儀器：血糖儀及血糖試紙(雅培制藥有限公司)；石蠟切片機(RM2135，LEICA公司)光學顯微鏡(CX31，OLYMPUS公司)；成像分析軟件[ISCapture(V3.5)，深瞳光電科技有限公司]。(3)試劑：鏈脲佐菌素(STZ，Cayman Chemical公司，批號：061002)；蘇木精(上海市化學試劑公司)；伊紅(北京化工廠)；Zona Occludens 1(ZO-1，Abcam公司，批號：ab216880)；Anti-Occludin antibody(Occludin，Abcam公司，批號：ab222691)；生物素—鏈霉卵白素免疫組化檢測試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；濃縮型DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)；高脂飼料(北京博泰宏達生物技術有限公司，脂肪所占熱量比為34%)；普通飼料(河北醫科大學實驗動物中心，脂肪所占熱量比為13%)。

1.2 方法

1.2.1 造模：早期肥胖組大鼠喂養高脂飼料，以肥胖度≥20%為造模成功，肥胖度計算公式：肥胖度(%)=(實驗組實際體重-對照組平均體重)/ 對照組平均體重×100%，造模成功后繼續高脂飼料喂養2周[6]；早期T2DM組大鼠高脂飼料喂養后，腹腔注射低劑量鏈脲佐菌素(STZ，30mg/kg)，以空腹血糖≥11.8mmol/L為造模成功，并繼續以高脂飼料喂養2周[7]；早期T1DM組大鼠喂養普通飼料，腹腔注射高劑量鏈脲佐菌素(STZ，60mg/kg)，以空腹血糖值≥16.7mmol/L為造模成功，并繼續喂養2周[8-9]；對照組大鼠喂養普通飼料并給予等量生理鹽水。

1.2.2 HE染色：實驗前將大鼠禁食12h，自由飲水。實驗時尾靜脈取血測定空腹血糖，處死，取空腸組織置于固定液中固定24h，梯度濃度乙醇脫水，浸蠟，包埋，制作成石蠟切片，將組織切片進行脫蠟，水化，透明，蘇木精—伊紅染色，封片。

1.2.3 免疫組化染色：將組織切片進行脫蠟、水化；將切片浸入抗原修復液中加熱后冷卻；滴加過氧化氫，用山羊血清封閉；加入一抗ZO-1(1∶100)、Occludin(1∶100) 4℃過夜；加入二抗，PBS沖洗；DAB顯色；蘇木精染核；脫水、透明、封片。

1.3 觀察指標 將各組大鼠禁食12h，測定各組大鼠造模前、成模后、成模后1周、成模后2周的空腹血糖；采用光學顯微鏡觀察空腸組織切片的組織形態結構變化，利用ISCapture(V3.5)成像分析軟件測量內環肌、外縱肌、黏膜下層的厚度及空腸絨毛、腺體的長度并計算絨腺比；空腸組織切片經免疫組化染色后，觀察緊密連接蛋白ZO-1與Occludin表達。

2 結果

2.1 血糖 實驗前各組大鼠血糖無顯著差異；成模后、成模后1周和成模后2周，對照組與早期肥胖組大鼠血糖無顯著差異，早期T2DM組與早期T1DM組比對照組大鼠血糖升高(P<0.01)，見表1。

表1 各組大鼠血糖變化比較

2.2 HE染色 根據HE染色結果顯示，對照組大鼠空腸黏膜完整，早期肥胖組大鼠絨毛排列整列、完整；早期T2DM組大鼠絨毛雜亂無序，長短不一；早期T1DM組大鼠絨毛雜亂無序，大量絨毛斷裂。統計結果顯示，各組間大鼠空腸組織的外縱肌和內環肌的厚度無顯著差異；早期T2DM組和早期T1DM組黏膜下層厚度均有增加(P<0.05,P<0.01)；各組大鼠空腸組織的絨腺比無明顯差異，見表2、圖1。

圖1 空腸組織形態變化

表2 各組大鼠空腸形態結構變化比較

2.3 免疫組化染色 免疫組化染色結果顯示，與對照組相比，早期肥胖大鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達明顯增加(P<0.05)，而T2DM大鼠空腸緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達量無明顯變化；T1DM大鼠緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達明顯減少(P<0.01)，見圖2。

3 討論

肥胖和糖尿病等代謝性疾病常伴隨著腸道病變[10]，其主要的病理特征為腸黏膜屏障受損，小腸上皮細胞緊密連接蛋白表達異常，導致腸道通透性增加，細菌發生移位，釋放大量炎癥因子，危害患者生命健康，因此，探究糖尿病、肥胖等代謝性疾病導致腸道不同的病理變化至關重要。本研究中，早期肥胖組大鼠空腸絨毛排列整齊、完整，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達增加；早期T2DM組大鼠空腸絨毛雜亂，長短不一，腸黏膜下層增厚，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達無顯著變化；早期T1DM大鼠空腸絨毛雜亂無序、斷裂，絨毛表面積減少，腸黏膜下層增厚，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin表達降低。研究結果顯示，緊密連接蛋白ZO-1、Occludin在早期肥胖大鼠中表達增多，早期T1DM中表達降低，而在早期T2DM大鼠空腸中其表達介于早期肥胖與早期T1DM大鼠之間，推測可能是由于T2DM存在高脂飲食和血糖升高兩因素，一方面導致腸黏膜下層增厚影響空腸功能，另一方面在影響空腸緊密連接蛋白表達方面相互拮抗，而使其病理變化差異不顯著。

圖2 空腸組織ZO-1、Occludin表達量變化

綜上所述，早期糖尿病與高脂誘導的肥胖均可導致空腸形態結構改變，腸黏膜屏障受損，緊密連接蛋白表達出現差異性變化，揭示了不同類型代謝性疾病早期空腸不同的病理變化，為腸道病變的早期干預，提供重要實驗依據與研究思路。