超高效液相色譜-串聯質譜法測定化妝品中的6種鎮痛類化學成分

董亞蕾，喬亞森，黃傳峰，王海燕，孫 磊

（中國食品藥品檢定研究院，國家藥品監督管理局化妝品研究與評價重點實驗室，北京 100050）

隨著化妝品市場規模的不斷擴大，我國已成為世界上第二大化妝品消費市場。人們對化妝品的質量要求越來越高，同時對其安全性問題也日漸重視。為滿足不同人群的需要，化妝品品類深度細分，各種不同目的、不同功效、不同使用場景的化妝品層出不窮［1］。但為盲目追求產品功效，不法生產商向化妝品中違規添加各類化學藥物，導致皮膚不良反應甚至損害人體健康的事件時有發生［2］。例如，非那西丁是解熱鎮痛藥，但會嚴重損害腎臟甚至誘發癌癥，已被許多國家禁售。雙氯芬酸鈉和吲哚美辛是常見的非甾體類抗炎鎮痛藥物，使用不當會引發不良反應，甚至導致休克和衰竭。保泰松是吡唑酮類消炎鎮痛藥，具有祛痘、抗粉刺等功效，但長期使用會造成人體多器官慢性損傷。這些藥物成本低廉，能夠顯著緩解疼痛，可被添加在祛痘、舒緩、防曬和曬后修復等化妝品中，以降低皮膚痛感，消費者在不知情的情況下長期使用，將會引起健康危害。

鎮痛類藥物的測定方法主要有電致發光法［3］、高效液相色譜法［4］、液相色譜-串聯質譜法［5］，但已報道的研究大多集中在中成藥［6-7］、保健食品［8］。目前關于化妝品中鎮痛類藥物的研究較少，我國也尚未制定相關的標準檢測方法。根據文獻報道，高效液相色譜法被用于測定化妝品中的保泰松［9］和氯苯那敏［10］，染發劑中的非那西丁［11］以及植物精油中的雙氯芬酸鈉［12］。超高效液相色譜-串聯質譜法（UHPLC-MS/MS）被用于同時測定祛痘類化妝品中的保泰松和氨基比林［13］。UHPLC-MS/MS 法高效快速、靈敏度高、準確度好，適合于痕量物質檢測，在化妝品中非法添加化學藥物的檢測方面具有顯著優勢［14-15］。目前，同時測定化妝品中多種鎮痛類藥物的UHPLC-MS/MS法尚未報道。

本研究選擇非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氨基比林、氯苯那敏6 種鎮痛類化學成分作為目標物，通過對前處理條件、色譜條件、質譜條件的優化，采用UHPLC-MS/MS 建立了同時測定膏霜、面膜、啫喱和噴霧等化妝品中6 種鎮痛類化學成分的方法。該方法提高了檢測靈敏度和檢測效率，為化妝品安全監管工作提供了可靠的檢測方法和技術支撐。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

Triple Quad 4500 型高效液相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（美國AB SCIEX 公司）；G10 型離心機（北京白洋醫療器械有限公司）；Vortex-5 渦旋振蕩器（江蘇省海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；KQ-700DE型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；AL204型電子天平（美國Sartorius公司）。

非那西丁標準品（純度100.0%，北京振翔科技有限公司）；雙氯芬酸鈉（100.0%）、吲哚美辛（99.9%）、保泰松（99.8%）、氨基比林（99.7%）、氯苯那敏馬來酸鹽（99.7%）標準品均來自中國食品藥品檢定研究院；乙腈、乙酸銨（質譜純，美國Fisher公司）。

1.2 標準溶液配制

精密稱取氨基比林、非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氯苯那敏馬來酸鹽標準品10 mg，加入甲醇溶解，分別配制成質量濃度為1 mg/mL 的標準儲備溶液備用，4 ℃避光保存。取適量標準儲備液，分別用甲醇稀釋成質量濃度為10 mg/L的標準中間液。分別取標準中間液適量，用50%乙腈稀釋成質量濃度分別為5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列標準混合溶液。

1.3 樣品前處理

稱取化妝品樣品0.2 g 于10 mL 具塞離心管中，加入2 mL 飽和氯化鈉，充分渦旋混勻，加入5 mL乙腈，渦旋分散，超聲提取5 min，以10 000 r/min 離心5 min。移取上清液，加入5 mL 乙腈重復提取1次，合并提取液。提取液用水稀釋2倍，經0.22 μm微孔濾膜過濾后，待測定。防曬噴霧類化妝品經超聲去除推進劑后稱樣進行前處理。

1.4 液相色譜-串聯質譜條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；柱溫：35 ℃；進樣體積：10 μL；流動相A：水（含5 mmol/L 乙酸銨），流動相B：乙腈（含5 mmol/L 乙酸銨）；流速：0.3 mL/min。梯度洗脫程序：0~10 min，5%~95%B；10~12 min，95%B；12~12.5 min，95%~5%B；12.5~14 min，5%B。

1.4.2 質譜條件離子化模式：ESI+；掃描模式：多反應監測（MRM）模式；電噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度：550 ℃；氣簾氣壓力：0.17 MPa；霧化氣壓力：0.38 MPa；輔助氣壓力：0.38 MPa。6種鎮痛類藥物的母離子、子離子、去簇電壓（DP）、碰撞能（CE）等質譜參數見表1。

表1 6種化合物的質譜參數Table 1 MS parameters of the 6 compounds

2 結果與討論

2.1 樣品前處理條件的優化

2.1.1 提取溶劑的選擇向空白的膏霜、面膜、啫喱和噴霧化妝品基質中加入6 種待測化合物混合標準溶液，以該加標樣品為研究對象，考察了甲醇、乙醇、乙腈3種常用有機試劑作為提取溶劑的效果。結果顯示，在面膜和噴霧基質中，上述3種提取溶劑對6種化合物回收率的影響不大。但在膏霜基質中，采用甲醇作為提取溶劑時，6 種化合物的回收率低于乙醇和乙腈（如圖1）。乙醇和乙腈作為提取溶劑時各化合物的回收率比較接近，但采用乙醇提取樣品時，提取液經水稀釋后產生渾濁現象，導致過膜困難。同樣的現象也存在于啫喱基質中。因此，最終采用乙腈作為提取溶劑。

圖1 不同提取溶劑對膏霜基質中6種化合物回收率的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on recoveries of 6 compounds in cream sample

2.1.2 提取溶劑中甲酸含量的影響6 種待測化合物的結構各不相同，酸堿性差別較大，為獲得更好的提取效果，考察了向提取溶劑中加入不同含量甲酸對回收率的影響。結果表明，甲酸對化妝品中氨基比林的回收率影響較大。如圖2A 所示，不加甲酸時，在膏霜、面膜、啫喱和噴霧4種基質中氨基比林的回收率為83.9%~91.5%，加入的甲酸含量越高，氨基比林的回收率越低。這可能是由于氨基比林為堿性化合物，甲酸的存在導致氨基比林離子化，在有機相中的分配減少，因此提取效率降低。其他5種化合物的回收率受甲酸含量的影響不大。圖2B 為不同甲酸含量（0、0.2%、0.4%、0.6%）時5 種化合物回收率的平均值。除保泰松在面膜中的平均回收率為77.4%外，4種基質中其余5種化合物的平均回收率為97.9%~103%，標準偏差范圍較小，說明甲酸含量對其余5種化合物的回收率影響不大。因此，為使6種化合物均能獲得較好的回收率，選擇不加甲酸的純乙腈作為提取溶劑。

圖2 提取溶劑中甲酸（FA）含量對氨基比林（A）和其它5種化合物（B）平均回收率的影響Fig.2 Effect of formic acid（FA）in extraction solvent on the recoveries of aminopyrine（A）and other 5 compounds（B）

2.1.3 提取方式的影響對化妝品進行液液萃取（LL）時，基質的充分分散有利于目標化合物的充分提取［16］。向化妝品加入少量飽和氯化鈉，有利于膠束破乳，促進基質分散，同時可促進水相與乙腈之間分層。在加標水平為25 μg/L，提取溶劑體積為10 mL 時，考察了提取方式對加標回收率的影響。提取方式如下：一種是直接采用10 mL 乙腈進行一步提取（記為LL-1）；另一種是將提取溶劑分為2 次，每次5 mL 進行分步提取（記為LL-2）。4 種基質中6 種化合物采用不同提取方式的回收率見表2。由表2可知，相比一步提取，采用分步提取能獲得更高的回收率。因此，最終采用10 mL乙腈分步提取方式進行樣品前處理。

表2 6種化合物在一步提取（LL-1）和分步提取（LL-2）時的加標回收率（%）Table 2 Recoveries of six compounds with one step extraction（LL-1）and step by step extraction（LL-2）（%）

2.1.4 超聲提取時間的影響在加標濃度為25 μg/L時，考察了超聲時間對6 種化合物回收率的影響。如圖3 所示，膏霜基質中保泰松的回收率受超聲時間的影響較大，超聲5 min 時的回收率最高，此后隨著超聲時間的延長，回收率顯著下降。氨基比林的回收率也從92.2%降至78.0%，其他化合物的回收率隨超聲時間的延長而略有降低。面膜、啫喱和噴霧3種基質中，6種化合物的回收率受超聲時間的影響不大，且均能達到80%以上。因此，選擇最佳超聲提取時間為5 min。

圖3 超聲時間對膏霜化妝品中6種化合物加標回收率的影響Fig.3 Effect of ultrasonic time on the recoveries of six compounds in cream

2.2 色譜條件的優化

2.2.1 色譜柱的選擇根據6種化合物的結構特點，采用混合標準溶液（10 μg/L）比較了BEH Shield RP18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）、CORTECS C8（2.1 mm ×100 mm，2.7 μm）和BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）3 種色譜柱的分離效果。結果表明，采用前兩種色譜柱時，大部分化合物出現峰拖尾、峰形差等現象。而采用BEH C18柱時，6種化合物的保留時間有所區分，分離度較好，且能夠獲得較好的峰形。因此，最終采用BEH C18柱進行實驗。

2.2.2 流動相的優化比較了甲醇-水和乙腈-水2 種流動相體系對6 種化合物分離效果的影響，結果表明2 種流動相對分離效果的影響不大。考慮到提取溶劑為乙腈，因此流動相采用乙腈-水體系。考察了甲酸、甲酸銨和乙酸銨3 種流動相添加劑對分離效果的影響。結果顯示，在相同的梯度洗脫條件下，采用甲酸為流動相添加劑時保泰松的峰分叉嚴重，氨基比林的峰形較差；采用甲酸銨時，大部分化合物不出峰；以5 mmol/L 乙酸銨為添加劑時，6 種化合物均能獲得較好的峰形和分離效果。這可能是由于乙酸銨體系可以改善含堿性基團化合物的峰形。因此，選擇最佳流動相為含5 mmol/L 乙酸銨的乙腈和水。

2.2.3 進樣溶劑的優化由于提取溶劑為純乙腈，而初始流動相中含有大量水，流動相的洗脫能力弱于樣品溶劑，導致色譜分離過程中溶劑效應顯著［17-18］，6種化合物的峰形展寬嚴重。為克服溶劑效應，采用稀釋劑對樣品提取液進行稀釋后再進樣。以6 種化合物混合標準溶液（10 μg/L）為研究對象，考察了進樣溶劑中乙腈比例分別為30%、40%、50%、60%、70%、80%時對分離效果的影響。結果顯示，采用30%~60%乙腈作為進樣溶劑，6 種化合物的色譜峰均峰形尖銳，峰面積相差不大，但乙腈比例為50%時能夠獲得更大的峰面積。繼續增大乙腈的比例，6 種化合物的保留時間均縮短，但峰形變差。因此，進樣溶劑中最佳乙腈比例為50%。

2.3 質譜條件的優化

采用合適質量濃度的標準品溶液，在MS Only模式下，通過針泵注射將單標溶液進入質譜，調整質譜條件獲得各化合物的母離子信息。將母離子打碎，尋找合適的特征子離子，再通過優化碰撞能、去簇電壓等條件，得到各化合物的特征碎片離子及相應的質譜條件。最終，在正離子模式及MRM模式下對6種化合物的混合標準溶液進行掃描，能獲得穩定的母離子和子離子。最佳實驗條件下，6種化合物（質量濃度為50 μg/L）的提取離子色譜圖如圖4所示。

圖4 6種化合物的提取離子色譜圖（50 μg/L）Fig.4 Extract ion chromatograms of 6 compounds（50 μg/L）

2.4 基質效應

采用基質匹配標準曲線和溶劑標準曲線，以兩者斜率之比考察了方法的基質效應。比值越接近1，說明基質效應越小。結果表明，氯苯那敏在4種基質中的基質效應為150%左右，說明存在基質增強效應，其它5 種化合物在4 種基質中的基質效應為30.5%~50.1%，說明存在基質抑制效應。克服基質效應常用的方法有采用同位素內標、改進色譜分離、采用基質匹配標準物質進行校正等［19］。其中，采用基質匹配標準曲線進行校正的效果良好，且具有廉價、操作簡便的特點［20］。因此，實驗分別選用膏霜、面膜、啫喱和噴霧作為4種代表性基質，采用基質加標法定量，以消除基質效應的影響。

2.5 方法學評價

2.5.1 線性關系與檢出限分別采用膏霜、面膜、啫喱和噴霧樣品為空白基質，配制基質匹配標準溶液，采用本方法進行前處理和測定，以6 種化合物定量子離子的峰面積對相應的質量濃度進行線性擬合，繪制標準曲線。結果表明，6種化合物的線性范圍為5~200 μg/L，相關系數（r）均大于0.99。分別以3 倍信噪比和10 倍信噪比計算檢出限（LOD，S/N=3）和定量下限（LOQ，S/N=10），6 種化合物的LOD 均為0.15 μg/g，LOQ 均為0.50 μg/g（見表3）。該方法適用于膏霜、面膜、啫喱和噴霧類化妝品中6種化合物的同時測定。

表3 6種化合物在不同基質中的線性范圍、相關系數、檢出限和定量下限Table 3 Linear ranges，correlation coefficients，LODs and LOQs of 6 compounds in different matrix

2.5.2 精密度采用上述4種基質的空白加標樣品，在相同條件下平行處理6份并采用本方法進行測定，以測定結果的相對標準偏差（RSD）評估方法的日內精密度。在相同條件下連續測定3 d，計算得到方法的日間精密度（見表4）。結果顯示，該方法在處理不同基質類型的化妝品時，日內RSD 均不大于7.9%，日間RSD均不大于9.7%，說明方法的精密度良好。

表4 不同基質中6種化合物的精密度（%）Table 4 Precisions of 6 compounds in different matrix（%）

2.5.3 回收率為驗證方法準確度，在膏霜、面膜、啫喱和噴霧4種空白樣品中進行3個濃度水平的加標回收實驗，每個濃度水平平行6 份，計算平均回收率和RSD（見表5）。結果表明，6 種化合物在4 種基質中的回收率為75.0%~120%，RSD 為0.72%~8.6%。該方法靈敏、準確、有效，能夠用于多種類型化妝品中6種鎮痛類藥物的同時測定。

表5 不同基質中6種化合物的平均回收率和RSD（%）Table 5 Average recoveries and RSDs of 6 compounds in different matrix（%）

2.6 實際樣品的分析

采用該方法測定10批膏霜、6批乳液、4批啫喱和4批防曬噴霧等具有祛痘和曬后修復功效的化妝品中6種目標化合物的含量，結果均未檢出。圖5為某款啫喱加標樣品的總離子流圖，在該圖基礎上提取6個化合物的色譜圖，峰形尖銳，無基質干擾，證明該方法可用于實際樣品的分析。

圖5 某款啫喱加標樣品的總離子流圖（加標濃度：5 μg/L）Fig.5 Total ion chromatogram of 6 components（added 5 μg/L）spiked in a gel sample

3 結 論

本文建立了UHPLC-MS/MS 測定膏霜、面膜、啫喱和防曬噴霧類化妝品中非那西丁、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、保泰松、氨基比林和氯苯那敏含量的方法。該方法前處理簡單、靈敏度高、準確性好，可用于化妝品中6 種鎮痛類化學成分的測定，為祛痘和曬后修復類化妝品中非法添加鎮痛類化學成分的檢測提供了技術支撐。