一種測量化學發光免疫分析儀用參考光源的設計和研究

鄧振進，黃海萍，曹俐，周陽，鄔鵬程，高飛，劉向榮，姚健，彭明霞，陳新平

1. 湖南省醫療器械檢驗檢測所，湖南 長沙 410011；2. 湖南樂準智芯生物科技有限公司，湖南 長沙 410205

引言

化學發光是化學反應過程中產生光的現象，這個過程可以被描述為：A+B→[I]*→產物+光[1]，其中，[I]*是反應過程中形成的不穩定的中間物質，處于激發態，由于很不穩定，會釋放出多余的能量回遷到穩定的基態，同時多余的能量以光能的形式發射出來[2]?；瘜W發光免疫分析儀是將化學發光和免疫分析結合起來的技術，通過標記的抗原或抗體與待測物進行一系列免疫反應[3]，最后通過測定發光強度得出待測物含量[4]。

化學發光過程釋放的能量非常微弱，低于常規光學儀器檢測量程，很難對微弱光強度的重復性、穩定性、光源線性等參數進行控制，目前國內化學發光免疫分析儀生產商大部分采用試劑進行生產質量控制，其弊端主要有：① 不同生產商可能選擇不同的發光體系，難以做到“標準化”；② 部分發光體系是閃光型發光（如魯米諾-過氧化氫體系），配制的試劑穩定發光期在30 min以下，不易重復測量[5]；③ 試劑成本昂貴，不利于日常生產的質量控制[6]。為了解決上述弊端，本研究擬研發一款光源，一方面要適應全部發光體系，使標準化成為可能，另一方面要使用方便，造價低廉。

1 方法

設計主要從設計內容、設計指標和設計方案三個方面考慮，而設計內容主要考慮光源結構設計、電路設計、光源調控設計和化學發光免疫分析儀用參考光源四個方面，具體內容，見表1。

表1 考慮設計內容

1.1 光源結構設計

根據化學發光免疫分析儀使用的生物芯片結構和尺寸設計，光源外形與生物芯片尺寸完全相同（根據不同免疫分析儀的結構可定制）。如圖1～4所示，參考光源（包括母光源）與生物芯片結構尺寸完全相同，能夠較好地在儀器中使用。圖1～2示光源結構與生物芯片外形完全一致；圖3示光源開關、濾光片插槽位于光源背面；圖4示光源充電口位于光源側面。

圖1 生物芯片外形圖

圖2 參考光源前視圖

圖4 參考光源三維圖

1.2 電路設計

供電使用紐扣電池（尺寸較小，適合參考光源結構小型化）或鋰電池（可充電，反復使用）；由于鋰電池或紐扣電池在使用過程中電壓會逐漸降低，影響光源發光穩定[7]。電路中采用MAX1724芯片穩壓，將電池的電壓升壓至5 V后穩定輸出。即使電池電壓降低，也能保證電路5 V恒壓供電。當電池電壓低于0.8 V時，升壓模塊停止工作，光源熄滅。如圖5所示，該電路利用兩個NPN型三極管Q2和Q3及電阻R9形成恒流模塊，保證能夠恒流供電給發光件，進而保證發光件處的穩定光強輸出，光子計數穩定性CV<1%，滿足化學發光免疫分析儀使用要求。

圖5 母光源供電電路

1.3 光源調控設計

圖6未增加干涉濾光片或中性密度濾光片的光源為母光源，增加干涉濾光片或中性密度濾光片后構成參考光源。干涉濾光片可控制光譜輸出，中性密度濾光片可控制輸出光強[8]。

光源使用LED，單色或白色。單色LED可不使用干涉濾光片，根據所需光譜選擇合適的單色LED[9]。白色LED可配合干涉濾光片使用，干涉濾光片能有效地控制光源輸出光譜（干涉濾光片規格眾多，可根據需要選?。?/p>

選擇合適透過率的中性密度濾光片插入母光源中，可有效控制光源的輸出光強，構成參考光源。中性密度濾光片透過率可準確計量，濾光片透過率與光源相對強度呈正比，透過率可表述為光源相對光強，從而實現溯源[10]，可選濾光片型號和透過率，見表2。

表2 濾光片型號和透過率

擴散凝膠作為光擴散劑，能有效地將光散射，實現光源的均勻輸出[11]。該部分可以模擬試劑各方向均勻發光特點，提高光源與試劑發光的相似性。

外殼內還設計有位于發光件與第一中性濾光片之間光路上的反射片。發光件發出的光通過反射片反射后再經過第一中性濾光片，可以避免將發光件、第一中性濾光片、光輸出窗口設置在同一直線上，從而避免形成長直光路，縮小外殼在單一方向上的尺寸。

1.4 化學發光免疫分析儀用參考光源

如圖6所示，將合適透過率（τ=0.01%）的中性密度濾光片插入母光源中即構成參考光源，將光源強度衰減到儀器線性范圍下限，測量化學發光免疫分析儀的重復性、穩定性[12]；從表2中選擇5個中性密度濾光片，插入母光源中構成參考光源，光源強度覆蓋3個數量級，共構成5個參考光源，測量化學發光免疫分析儀的線性[13]。

2 結果

2.1 檢測裝置及示意圖

具有單光子探測器的測試裝置本身提供暗室或在光暗室內測量來排除環境干擾。單光子探測器光譜響應范圍需要覆蓋光源光譜范圍，同時單光子探測器需要在其線性范圍內工作[14]。如濱松H10682-110單光子探測器，測試距離：單光子探測器距離光源35 mm[15]，見圖7。

圖7 檢測裝置及示意圖

2.2 重復性測試

選用接近線性范圍下限的參考光源進行測試，連續測試10次，將所得數據按公式(1)～(2)計算變異系數（Coefficient of Variation，CV，%）[16-19]，重復性測試結果，見表3。

表3 重復性測試結果

其中，s是標準差，是10次測量結果的算術平均值，Xi是每次實測結果，n是實測的次數，CV是變異系數。

2.3 穩定性測試

選用接近線性范圍下限的參考光源進行測試，連續測試10次，兩次測試之間的間隔時間至少為3 min，記錄測光值，用公式(3)計算相對極差[16-19]，穩定性測試結果，見表4。

表4 穩定性測試結果

其中，Xmax是10次測量結果的最大值，Xmin是10次測量結果的最小值，是10次測量結果的平均值。

2.4 光源線性測試

至少使用5個強度的參考光源，參考光源發光強度覆蓋3個數量級，每個光源重復測量3次，并記錄參考光源的測量結果。計算各光源3次測量結果的平均值（yi）。以每個光源的標定功率或標定的功率相對值（xi）即透過率為自變量，以實際測試得到的發光值（yi）為因變量求出線性回歸方程，按照公式(4)計算線性回歸的相關系數r[16-19]。

其中，r是相關系數，xi是各個樣品的標定功率或標定的功率相對值，yi是各個樣品測定結果的均值，是標定功率或標定的功率相對值的均值是光源測定總結果的均值。

表5 光源線性測試結果

3 討論

目前國內化學發光免疫分析儀生產商大部分采用試劑進行生產質量控制，試劑難以做到“標準化”：配制的試劑穩定發光期在30 min以下，不易重復測量[6]且試劑成本昂貴。本研究根據化學發光免疫分析儀的原理和技術特性[16-19]，設計參考光源，發光件為普通的LED燈，本設計能夠實現皮瓦量級甚至更低光強級別的穩定光輸出；通過更換干涉濾光片可以實現任意中心波長的光譜輸出，從而模擬不同的化學發光試劑；通過更換第二中性濾光片可以實現線性光輸出；可用于化學發光免疫分析儀的校準或進行穩定性測試、重復性測試、線性測試；結構簡單，適用性好，成本低，測量結果準確可靠[20]，可在脫離試劑的情況下對儀器進行測試，滿足儀器注冊檢測、性能評價的需求。參考光源的設計具有重大的科學意義和實用價值，批量生產中能提高出廠檢驗的效率，能夠對行業標準進行補充和完善，推動化學發光免疫分析行業發展。