幾種綠肥的根系分泌物對土壤鋅的活化效應

李欣雨，劉函亦，薛少琪，邢莉彬，彭亞茹，蒙元永，楊 瑜，黃冬琳

（西北農林科技大學資源環境學院/農業農村部西北植物營養與農業環境重點實驗室，陜西 楊凌 712100）

鋅是人體所需的微量元素，對人體健康起著至關重要的作用，我國大約有一億人鋅攝入量不足［1-2］。作物中鋅含量低主要受到土壤鋅缺乏的制約［3］，黃土高原石灰性土壤全鋅含量平均為69.1 mg/kg，然而，超過一半面積以上的土壤有效鋅含量低于臨界值0.5 mg/kg。因此，該區域作物缺鋅的主要原因是土壤中可供吸收利用的有效鋅較少，而并非土壤中鋅含量低［4-6］。石灰性土壤制約鋅有效性的因素主要為高pH值、高碳酸鹽含量、土壤有機質低和土壤水分缺乏［3］，其中土壤pH值對鋅的有效性影響最為顯著［7］。為解決土壤缺鋅問題，施用鋅肥是最為經濟、有效且易被接受的途徑［8-9］。我國石灰性土壤的鋅肥試驗表明鋅肥有效利用率不足1%，大部分鋅肥進入土壤都轉為無效的礦物態［10-13］，還存在潛在的環境風險。綠肥作為養分豐富的全能型肥，被納入我國農田種植體系，能夠培肥土壤，提高土壤鋅等微量礦物營養的供應［14-15］。

田間及盆栽試驗研究發現不同綠肥在提高石灰性土壤中有效鋅含量的同時，也可以有效增加后茬小麥鋅的含量［16-17］。黃土高原低鋅旱地研究發現，綠豆、懷豆和大豆3種綠肥與小麥輪作均可顯著提高小麥籽粒鋅含量，增幅為7.1%～28.6%［18］。不同綠肥對土壤鋅的活化能力及提高后茬小麥籽粒鋅含量的幅度與其自身吸收累積鋅呈正相關。綠肥將自身累積鋅通過翻壓還田、輸入土壤顯著增加土壤溶解性有機碳（DOC）含量，綠肥收獲期黑麥豆處理使土壤DOC含量提高了17.0%，土壤有效鋅含量顯著增加，且顯著高于其他處理［19-20］，因此，綠肥自身鋅吸收能力是其活化土壤鋅、提高后茬作物鋅含量的關鍵。不同或同一作物的不同品種吸收、富集環境介質中鋅的能力有很大差異，如青菜中，品種五月慢地上部的吸鋅量顯著高于品種黑油白菜，是后者的1.3倍［21］，大麥、油菜、青菜等作物也存在相似的現象［21-23］。植物生長過程中其根系向生長環境分泌大量無機離子和有機化合物來改善根際環境［24］。養分脅迫時，根系分泌物的成分和含量會發生變化以適應環境的改變。如植物缺鋅時，根系會分泌出大量無機離子和有機酸等低分子化合物［25］，其中低分子有機酸主要包括蘋果酸、檸檬酸、草酸、琥珀酸、甲酸、乙酸等［26］，由于含有大量羧基，且羧基是很好的陽離子交換基團，可以通過酸化、還原及配位交換等作用溶解和轉化一些難溶性礦物，增加Fe、Mn、Cu、Zn等營養元素在土壤中的可溶性和移動性，提高土壤鋅養分的有效性，促進植物吸收利用［21，27-31］。但由于它們攜帶不同的酚羥基和羧基功能團，對土壤礦質元素的活化存在一定的差異性，不同有機酸對土壤重金屬的活化能力不同［32-33］。

田間試驗研究發現不同綠肥對后茬小麥鋅含量的提高幅度不同，并與綠肥自身鋅吸收量成正比［20］。綠肥利用土壤鋅能力存在的差異，是否與其根系分泌物有機酸成分及分泌量有關？根系分泌的有機酸在活化土壤鋅能力上是否存在差異？本研究將對綠肥根系分泌物進行分析鑒定，探明不同綠肥根系分泌有機酸在組成和數量上的差異，并通過比較不同有機酸對土壤鋅的浸提效果，以期深化不同綠肥對土壤鋅活化效應，為通過綠肥活化土壤鋅的生物強鋅手段提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 不同綠肥吸鋅量差異的比較

1.1.1 試驗區概況及試驗設計

田間試驗位于陜西省咸陽市永壽縣御駕宮鄉御中村（34°43′N、108°11′E），旱地雨養農業區，主要耕作制度為一年一熟，夏閑期為7～9月。田間試驗開始于2015年6月，本研究的時間為2017年7～8月。綠肥生長期為7月初到8月底，綠肥盛花期收獲后種植小麥。年平均溫度10.5℃，無霜期210 d，平均年降水量530 mm。

田間試驗為裂區設計：主區處理為3種不同的綠肥，分別為黑麥豆、綠豆、高丹草。副區處理為施鋅（ZnSO4·H2O 15 kg/hm2）和不施鋅兩個處理，4次重復。土壤類型為黑壚土，試驗開始時0～20 cm土壤有機質含量12.92 g/kg，全氮含量0.82 g/kg，硝態氮含量11.9 mg/kg，銨態氮含量4.57 mg/kg，有效磷含量11.2 mg/kg，速效鉀含量113.5 mg/kg，pH值8.4。施鋅和不施鋅處理DTPA-Zn含量分別為1.74和0.38 mg/kg。

1.1.2 樣品采集與測定

每個小區隨機采集30株綠肥（翻壓前）作為分析樣品。取部分樣品用去離子水清洗后90℃殺青30 min，65℃烘至恒重，用氧化鋯球磨儀（萊馳MM400，德國）磨細，備用。粉碎的植物樣品用HNO3-H2O2微波消解儀（安東帕MWPro）消解，原子熒光光譜法（日立Z2000）測定綠肥各器官鋅含量。

1.2 綠肥根系分泌物有機酸的分離與測定

1.2.1 試驗材料與試劑

供試作物：黑麥豆（品種為永壽縣當地品種）、綠豆（品種為橫山綠豆）、高丹草（品種為百寶飼）。有機酸標品：草酸、檸檬酸、富馬酸、琥珀酸，均購自百靈威科技，純度為99%。流動相試劑：乙腈、磷酸氫二銨，均為色譜純。

1.2.2 水培試驗

培養液成分：4 mmol/L Ca（NO3）2·4H2O、6mmol/L KNO3、1 mmol/L （NH4）2HPO4、0.6 mmol/L MgSO4·7H2O、46 μmol/L H3BO3、9 μmol/L MnCl2·4H2O、0.3 μmol/L CuSO4·5H2O、0.7 μmol/L MoO3、50 μmol/L Fe-EDTA。

試驗設2個鋅營養水平Zn0、+Zn（0.5 μmol/L ZnSO4·7H2O），重復3次。

選取籽粒飽滿且大小一致的綠肥種子，20%H2O2消毒5 min，用蒸餾水沖洗干凈后浸泡4 h，將種子散放在已滅菌且底部放有濕潤濾紙的培養皿上，在20～25℃的培養箱中避光催芽，當子葉露出時照光培養。當根長至5～8 cm時，取生長狀況均一的幼苗，移栽到營養液進行培養，加蒸餾水保持營養液體積不變。營養液最初濃度為正常濃度的1/2。每盆定植4株，盆的容積為1 L，采用小型通氣泵連續通氣。5 d后換成正常濃度進行培養，營養液pH值為6.30±0.01，之后每5 d更換一次營養液。嚴格控制人工氣候室條件，晝/夜溫度為25/20℃，相對濕度為65%～75%。

1.2.3 根系分泌物的收集與分離

分別將培養10和20 d的黑麥豆、綠豆和高丹草幼苗，用蒸餾水沖洗干凈，將其放入盛有200mL蒸餾水的250 mL三角瓶中并加入3 滴0.05%（體積分數）的百里酚溶液，用鋁箔紙包裹三角瓶遮光。在人工氣候室光照收集12 h后，收集液用0.45 μm微孔濾膜抽濾，冷凍干燥機凍干，用超純水定容至1 mL，-20℃下保存［34］。由于綠肥之間存在生物量差異，本研究引入單位生物量植物根干重的分泌量作為綠肥分泌量的評價指標。

1.2.4 有機酸的測定

用總有機碳分析儀（TOC-VCPH島津，日本）測定DOC含量，超高效液相色譜儀（LC-30A島津，日本）測定有機酸。有機酸標品在213 nm處均有較大且穩定的吸收峰，故確定檢測波長為213 nm。磷酸鹽緩沖液是最典型的洗脫液，可作為有機酸測定的流動相［35］。試驗表明，流動相為NH4H2PO4（0.01 mol/L，pH 2.9）∶乙腈=98∶2時，峰形尖銳并可以有效地進行分離。當柱溫為40℃且流速為0.5 mL/min時，有機酸分離效果較好，如圖1。本試驗對C5以下的低分子量有機酸進行了檢測，分別為草酸、酒石酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、甲酸、乙酸、乳酸和富馬酸共9種有機酸，綠肥根系分泌物中檢測到的低分子量有機酸僅4種，即草酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸，其他均低于檢測范圍。

圖1 有機酸標準品色譜圖

稱取草酸0.01 g、檸檬酸0.05 g、琥珀酸0.1 g和富馬酸0.01 g，用超純水定容至100 mL，即為混標原液。將原液分別進行2、4、10、20、50、100、200、500倍稀釋，進樣5 μL，按照色譜條件進行分析，并以有機酸的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。4種有機酸的線性回歸方程、決定系數R2、保留時間、線性范圍以及相對標準偏差（RSD）見表1，4種有機酸回歸方程的決定系數均能達到0.9999以上，這說明采用標準曲線法來計算該試驗中有機酸的濃度具有較高的可行性［36］；5次平行進樣后測得標樣酸含量的相對標準偏差為0.53%～1.94%，說明該方法重現性較好，對綠肥根系分泌物中有機酸含量的測定具有穩定性和可靠性［35］。

表1 4種有機酸的標準曲線

1.3 有機酸對土壤鋅的浸提

供試土壤為2017年綠肥播前永壽縣綠肥-小麥輪作田間試驗施鋅小區0～20 cm土壤，采回的土樣經自然風干，除去雜質，過2 mm篩后備用。以液土比10∶1添加各有機酸草酸、檸檬酸、琥珀酸、富馬酸，均設6個濃度處理：0、0.3、0.6、1.2、1.8、3.0 mmol/L，稱取風干土3 g加入100 mL離心管中，并加入30 mL有機酸浸提液（0.01 mol/L CaCl2，3滴0.1%百里酚），在往復振蕩器上振蕩24 h，20℃，振蕩完畢后立即測定土壤pH值；以4500 rpm離心10 min，取上清液過濾后在火焰原子吸收光譜儀（PinAAcile900F美國PE，美國）上測定溶液中Zn含量，重復3次［37］。

2 結果與分析

2.1 不同綠肥地上部鋅含量的差異

田間試驗結果表明，綠肥種類及施鋅水平均顯著影響綠肥地上部的鋅含量（圖2）。未施鋅處理下，黑麥豆地上部鋅含量最高，為25.17 mg/kg，顯著高于高丹草，綠豆鋅含量與高丹草之間無顯著差異。施鋅條件下，黑麥豆地上部鋅含量顯著高于綠豆和高丹草，分別高了34.73%和26.30%。施鋅顯著提高了綠肥地上部的鋅含量，且黑麥豆鋅含量的增加幅度高于其他兩種綠肥。

圖2 不同綠肥地上部的鋅含量

2.2 綠肥根系溶解性有機碳與總有機酸分泌量

溶解性有機碳反映了根系分泌總有機化合物的含量。水培試驗結果（圖3）表明，兩個供鋅水平下，3種綠肥溶解性有機碳分泌量之間無顯著差異。+Zn處理綠肥根系分泌溶解性有機碳含量相比于Zn0處理均顯著增加，其中黑麥豆、綠豆和高丹草較Zn0分別增加了59.07%、74.05%和37.12%。綠肥根系總有機酸分泌量與溶解性有機碳分泌量的趨勢類似，+Zn處理綠肥根系總有機酸分泌量顯著高于Zn0處理，其中黑麥豆、綠豆和高丹草較Zn0處理分別增加了66.04%、59.15%和49.46%。Zn0處理下，3種綠肥根系總有機酸分泌量之間無顯著差異；+Zn處理下，黑麥豆與其他兩種綠肥根系總有機酸分泌量之間存在顯著差異，其分別是綠豆和高丹草的1.24和1.34倍。

圖3 不同綠肥根系溶解性有機碳及總有機酸分泌量

總有機酸與溶解性有機碳分泌量的比值反映了綠肥在特定條件下根系分泌有機酸的相對能力。由圖4可知，該比值為5.95%～7.64%，Zn0處理下，黑麥豆根系總有機酸與溶解性有機碳分泌量的比值最高，高丹草最低；+Zn處理下，3種綠肥根系總有機酸與溶解性有機碳分泌量的比值之間無顯著差異；且黑麥豆和綠豆在兩個施鋅水平之間也無顯著差異。

圖4 綠肥根系分泌總有機酸與溶解性有機碳分泌量的比值

2.3 不同綠肥根系分泌主要有機酸的差異

不同綠肥根系分泌的主要有機酸之間存在較大的差異性。由表2和圖5可知，黑麥豆根系分泌物中草酸、檸檬酸和琥珀酸3種有機酸的分泌量約占其總有機酸分泌量的99.7%，其中琥珀酸的分泌量顯著高于其他兩種綠肥。草酸為綠豆根系分泌物中的優勢酸，其分泌量約占綠豆總有機酸分泌量的96.9%，草酸的分泌量顯著高于其他兩種綠肥。高丹草根系分泌的有機酸中草酸和琥珀酸約占其總有機酸分泌量的90.9%。從各有機酸的比例上看，3種綠肥根系分泌物的有機酸主要為草酸，草酸的分泌量為1181.3～5292.4 μg/g（根干重）。3種綠肥根系草酸的分泌量均占其總有機酸量的50%以上；而根系富馬酸的分泌量較低，為2.8～22.6 μg/g（根干重），均不超過總有機酸分泌量的0.5%（表3）。

表2 不同綠肥根系有機酸分泌量的差異（μg/g 根干重）

圖5 綠肥根系有機酸分泌量的比例

表3 供鋅狀況對綠肥根系有機酸分泌量的影響（μg/g 根干重）

2.4 生長期及不同供鋅水平綠肥根系分泌主要有機酸的差異

隨著綠肥生長時期的推移，其根系有機酸的分泌量呈增長趨勢（表3）。+Zn處理下，黑麥豆、高丹草根系草酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸的分泌量均呈現增長的趨勢，分別增加了4.1%、47.2%、405.6%、76.6%和34.8%、64.9%、86.0%、35.7%。Zn0處理下，高丹草根系草酸、檸檬酸、富馬酸和琥珀酸的分泌量也均呈現增長的趨勢，分別增加了39.3%、73.7%、114.0%和284.7%；而黑麥豆根系檸檬酸、富馬酸和琥珀酸的分泌量則呈降低的趨勢，分別降低了93.6%、33.3%和41.8%

比較不同供鋅水平（表3），+Zn處理多數綠肥根系有機酸分泌量高于Zn0處理。3種綠肥在+Zn處理下草酸、琥珀酸分泌量均高于Zn0處理，僅檸檬酸的分泌量與之呈相反趨勢。Zn0處理下高丹草根系檸檬酸、富馬酸的分泌量顯著高于+Zn處理，高丹草根系通過有機酸分泌能力的增強來響應低鋅脅迫。與Zn0處理相比，+Zn處理黑麥豆根系有機酸分泌量成倍增加，如水培20 d，+Zn處理下黑麥豆檸檬酸、琥珀酸、富馬酸的分泌量顯著高于其他兩種綠肥，其分泌量分別是綠豆和高丹草的36.7、887.3、4.0和4.8、8.4、5.9倍。

2.5 不同根系分泌物有機酸對土壤pH值及土壤鋅浸提能力的影響

土壤pH值與有機酸浸提液濃度的增加呈負相關關系（圖6 a），隨著有機酸浸提液濃度的增加，4種有機酸土壤浸提劑的pH值均呈下降趨勢，且不同有機酸浸提劑對pH值降低的幅度（擬合方程的斜率）不同，其中草酸降低pH值的能力最強，琥珀酸次之，檸檬酸和富馬酸最低。當4種有機酸浸提劑濃度為3 mmol/L，草酸、琥珀酸、富馬酸和檸檬酸浸提劑的pH值分別下降約0.58、0.39、0.23和0.18個單位，最終4種有機酸浸提劑的pH值穩定在7.3～7.5。

4種有機酸浸提液對土壤鋅都有較強的溶出能力（圖6 b），其中草酸對鋅的浸提能力最強，檸檬酸和富馬酸次之，琥珀酸最低。除琥珀酸外，浸提液中Zn2+濃度均與其他有機酸濃度呈正相關關系，即有機酸濃度越高，可溶出Zn2+越多。與圖6 a趨勢相似，有機酸對土壤鋅浸提的效果與其對土壤pH值的影響一致，草酸對土壤pH值的降低能力最強，其對土壤浸提態鋅的溶出能力同樣最強。

圖6 根系分泌主要有機酸對土壤浸提液pH值、鋅含量的影響

3 討論

不同綠肥對土壤中鋅的累積吸收有明顯差異。不論缺鋅還是施鋅處理，黑麥豆（豆科）地上部鋅含量與高丹草（禾本科）均呈顯著差異，且黑麥豆的鋅吸收累積能力較高。在Soltani等［38］的研究中也發現，豆科作物三葉草的鋅吸收量顯著高于非豆科作物，與本試驗結果一致。不同綠肥根系分泌物在C/N、DOC、氨基酸、有機酸的分泌量之間亦有很大不同［29，39］，對土壤中鋅元素的活化能力存在明顯差異，故影響了植株對土壤中鋅的吸收。因此，根系分泌物在綠肥吸收鋅的過程中可能起著重要作用。

植物根系分泌物成分復雜，其中溶解性有機碳含量是反映植物根系通過分泌作用向根際環境中輸入碳的情況［40］。相比其他兩種綠肥，黑麥豆根系溶解性有機碳、總有機酸分泌量均為最高，其次為綠豆、高丹草，說明黑麥豆通過根系分泌物向根際環境中釋放的有機碳較多［40］。且綠肥根系分泌4種主要有機酸量的大小為黑麥豆＞綠豆＞高丹草，豆科綠肥根系有機酸的分泌量高于禾本科高丹草。根系分泌物的組成是植物自身的生理特征，與植物的種類、遺傳特性有決定性的關系。如油菜的根系分泌物主要為檸檬酸和蘋果酸，而肥田蘿卜的根系分泌物主要為丁二酸、酒石酸和蘋果酸［41］。另一方面，植物根系分泌物的分泌量與植物生長量呈正相關關系［42］，與缺磷脅迫下的白羽扇豆排根有機酸分泌量隨根的生長而增加相似［43］。本研究中隨培養時間的推移，單位根系干重有機酸的分泌量呈增加趨勢。

植物在環境養分脅迫時，根系分泌物的成分和數量會產生急劇的變化以適應變化的環境。與以往的研究中養分脅迫條件下作物根系分泌量呈增加的趨勢結果不同［21，31，44-46］，本研究中綠肥在+Zn處理下根系有機酸分泌量高于Zn0處理。Zn0處理下，綠肥根系分泌的總有機酸含量顯著降低，低鋅脅迫下綠肥根系分泌的總有機酸僅為供鋅水平下的60.2%～66.9%。缺鋅不僅影響植株對其他元素的吸收，而且抑制根系的生長發育［47］，因此缺鋅可能使綠肥根系生長受到影響，從而導致根系分泌的有機酸明顯減少。Ohwaki等［48］研究發現，不同鋅營養水平會改變分泌物中有機酸、糖類和氨基酸之間的相對比例。兩種供鋅水平相比，+Zn處理豆科綠肥黑麥豆、綠豆根系主要的4種有機酸分泌量均高于Zn0處理，而禾本科綠肥高丹草則是Zn0處理下根系有機酸分泌量高于+Zn處理，這與洪常青等［49］、張福鎖［50］研究在低鋅脅迫下禾本科植物根系分泌物可以活化石灰性土壤中難溶性鋅的結果一致。田間試驗結果表明，施鋅條件下，綠肥鋅含量的增幅更高，其對后茬小麥鋅含量的影響也隨自身吸鋅能力增加而增加［20］，黑麥豆和綠豆輪作增鋅效果優于高丹草［19］，這可能與黑麥豆、綠豆在鋅供應充足時根系生長更為旺盛，其分泌有機酸、活化鋅的能力更強有關。因此，綠肥可能通過根系釋放小分子有機酸類物質，降低土壤pH值，提高可溶性有機碳含量以及土壤中植物可吸收利用的有效鋅含量進而提高后茬作物鋅含量。

綠肥根系草酸分泌量最高，其次為琥珀酸、檸檬酸，富馬酸最低。3種綠肥草酸的分泌量均占有機酸總量的50%以上，而富馬酸不超過0.5%。諸葛菜根系分泌的有機酸中草酸、蘋果酸和檸檬酸為優勢酸，占有機酸總量的75%以上［36］。草酸是籽粒莧根系分泌的優勢酸，占有機酸分泌總量的95%以上，因而籽粒莧分泌草酸的能力強是其高效利用土壤養分的重要機理之一［51］。與袁秀梅等［52］研究結果類似，本研究發現綠肥根系分泌的4種有機酸均能顯著降低土壤pH，對土壤鋅均有較強的溶出能力。其中，草酸降低土壤pH及溶出鋅的能力最強，具有較強的絡合能力和水解能力，而檸檬酸、琥珀酸、酒石酸等多元酸的絡合能力強、水解能力較弱，主要是通過絡合溶解作用活化土壤中的鋅和鐵等營養元素［52-53］。除琥珀酸外，浸出液中Zn2+濃度與有機酸濃度呈正相關關系，曾清如等［54］研究表明，檸檬酸、草酸、酒石酸、蘋果酸對土壤中微量元素活化能力較強，琥珀酸的活化能力相對較弱。隨著酸濃度的增加，浸出液中銅、鋅、鐵、錳基本上是增加的，而琥珀酸則無明顯的活化作用，其結果與本研究相一致。

4 結論

3種綠肥吸收累積鋅的能力存在差異，無論是否施鋅，黑麥豆吸鋅量均顯著高于綠豆、高丹草，并在土壤施鋅時差異更大。黑麥豆根系溶解性有機碳、總有機酸分泌量均高于綠豆、高丹草。供鋅提高了3種綠肥根系分泌有機酸的總量，其中黑麥豆的提升幅度相比其他較高。3種綠肥根系草酸的分泌量顯著高于其他有機酸，且草酸降低土壤pH及溶出土壤鋅的能力最強。黑麥豆根系溶解性有機碳及總有機酸的分泌量最高，且分泌的有機酸主要為草酸和檸檬酸，這可能是其活化土壤鋅，吸收累積鋅能力較高的原因。