滇重樓根際土壤解無機磷細菌的分離與鑒定

朱芙蓉，杜慧慧*，周 濃，*，楊 敏，郭冬琴，趙順鑫，李慶天

（1.重慶三峽學院生物與食品工程學院，三峽庫區(qū)道地藥材綠色種植與深加工重慶市工程實驗室，重慶 404120；2.大理大學藥學與化學學院，云南 大理 671000）

具有清熱解毒、抗癌抑菌等功效的藥用植物滇重樓（Paris polyphylla var. yunnanensis）是自然繁殖率低、生長緩慢的多年生草本植物，人類的肆意采挖致使其野生資源匱乏，已嚴重威脅醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展［1］。高效引種栽培可緩解供不應求的現(xiàn)狀，但科學合理施肥是提升滇重樓產(chǎn)量和品質(zhì)的關鍵［2］。磷元素作為植物生長的必需元素之一［3］，在土壤中的含量較高，但大多以難溶性物質(zhì)存在，不能直接被植物吸收利用，故常增施磷肥來滿足植株對磷元素的需求［4］。由于土壤的理化性質(zhì)和磷酸鹽的化學行為，磷肥的利用率只有10%～25%，大量磷元素以無效態(tài)形式存在，減少了磷的有效性［5-6］。長期施用化學肥料，會導致土壤板結(jié)，水體污染嚴重［7］，不符合綠色、可持續(xù)發(fā)展的理念。

作為土壤系統(tǒng)一部分的解磷微生物能夠?qū)㈦y溶性磷轉(zhuǎn)化為可溶性磷，進而提高土壤有效磷的含量，有利于植株對磷元素的吸收利用。解磷微生物的種類較多，包括細菌、真菌以及放線菌等［8］，其中解磷細菌的數(shù)量最多，是解磷真菌的2～50倍［9］。目前關于解無機磷菌株的篩選多集中于農(nóng)作物，如玉米、花生、大豆等［10-12］，對于藥用植物解無機磷細菌的篩選還未見報道。

本研究分別從四川、云南、貴州中10個不同地點分別采集移栽品和野生品滇重樓，通過稀釋根際土壤篩選解無機磷細菌，通過觀察菌落，分析其生理生化，利用16S rDNA分子測序分離鑒定解無機磷菌株，為滇重樓微生物菌肥提供解無機磷的優(yōu)良菌種，有助于提高滇重樓品質(zhì)和產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

采集樣品根莖周邊0～0.5 cm附著土壤，除去木質(zhì)、石塊等雜質(zhì)，混勻，放入無菌自封袋，4℃冰箱保存。滇重樓采集信息見表1。

表1 不同產(chǎn)地滇重樓樣品來源

1.2 培養(yǎng)基

無機磷固體培養(yǎng)基：瓊脂15 g，無機磷培養(yǎng)基17 g，蒸餾水1000 mL，1×105Pa 滅菌20 min。

種子液培養(yǎng)基：牛肉膏3 g，NaCl 5 g，蛋白胨10 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.4～7.6，1×105Pa滅菌20 min。

無機磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH4）2SO40.5 g，Ca3（PO4）25.0 g，NaCl 0.3 g，F(xiàn)eSO40.03 g，KCl 0.3 g，MgSO40.3 g，MnSO40.03 g，蒸餾水1000mL，pH 7.0～7.5，1×105Pa滅菌20 min。

1.3 菌株分離與純培養(yǎng)

稱取樣品土壤1 g，置于9 mL無菌水中，振蕩3 h，制備成10-6～10-1梯度的土壤稀釋液。吸取100 μL稀釋液，接種于已滅菌的培養(yǎng)基中，使用滅菌涂布棒涂抹均勻，37℃恒溫培養(yǎng)3～4 d后，挑取有解磷圈的菌株劃線純化細菌，重復3次。觀察并記錄培養(yǎng)基上菌株的菌落形態(tài)、大小及顏色，并進行革蘭氏染色。取單菌落菌株與50%甘油1∶1混合，-20℃保種。

1.4 解無機磷能力的測定

將菌株接種到無機磷固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d，測定解磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），計算D/d值，用以表示菌株的解磷能力。

使用種子液活化菌種48 h后吸取500 μL種子液接種于無機磷液體培養(yǎng)基中，無菌水為空白對照，置于37℃、180 r/min培養(yǎng)7 d。7 d后離心發(fā)酵液，取其上清液，采用鉬銻鈧比色法測定有效磷的濃度［13］，用pH計測定上清液的pH值。

1.5 菌株鑒定

1.5.1 菌株生理生化特性測定

參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［14］，將純化的解無機磷菌株進行接觸酶實驗、淀粉水解實驗、硝酸還原實驗、吲哚實驗、檸檬酸實驗、精氨酸雙水解實驗、蔗糖發(fā)酵實驗、葡萄糖發(fā)酵實驗、M.R實驗、尿素酶實驗、明膠實驗。

1.5.2 細菌16S rDNA分子生物學鑒定

參照天根細菌基因組DNA提取細菌總DNA，并進行濃度測定和純度分析。利用16S rDNA擴增引物27F-1115R（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1115R：5-AGGGTTGCGCTCGTTGC-3）［15］，對 菌 株進行PCR擴增，PCR反應程序如下：95℃ 6 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃10 min；4℃保存。PCR反應體系：2×PCR預混液10 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、模板1 μL，補水至20 μL。使用1%瓊脂糖凝膠純化并回收PCR產(chǎn)物，檢測后交由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用MEGA 5.0進行系統(tǒng)發(fā)育樹的建立：使用Clustal W多重序列比對所需序列，采用Neighbor-joining 算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2016進行數(shù)據(jù)分析，MEGA 5.0進行進化樹構(gòu)建。利用SPSS 25.0和GraphPad Prism 8進行數(shù)據(jù)分析和作圖，對不同菌株的可溶性指數(shù)、有效磷濃度、增磷量等進行單因素方差分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 解無機磷菌株的菌落特征

從不同生境的滇重樓根際土壤中分離純化得到42株解無機磷菌株，其菌落形狀多為圓形，中間扁平或凸起，顏色多為米白色或白色，大多表面濕潤，菌落邊緣大部分不整齊。

2.2 解無機磷能力測定

2.2.1 解無機磷能力的定性測定

將篩選出的42株解無機磷菌株培養(yǎng)后，測量解磷圈直徑（D）和菌落直徑（d），比較可溶性指數(shù)D/d值，初步得到菌株的解磷能力。由表2可知，Y2-2菌株的D/d值最大，為3.65；其次是Y6-2、Y8-3、Y1-1（D/d值 分 別 為3.31、2.86、2.73）。結(jié)合顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同菌株的解磷能力不同。

表2 解無機磷菌的菌落直徑、解磷圈直徑以及兩者的比值（n=3）

2.2.2 解無機磷能力的定量測定

通過鉬銻鈧比色法測定42株解無機磷菌株菌液中有效磷的含量。由表3和圖1分析可知，菌株Z3-4解磷能力最強，發(fā)酵上清液中有效磷的含量為104.10 mg/L、增磷量為38.55 mg/L、解磷率為37.03%；其次為Y7-4、Y1-1、Y9-1。42株菌株發(fā)酵液的pH為3.93～5.70，均顯著下降。其中，Z3-4菌株增磷量最高，但pH為4.31，不同解磷菌在溶磷過程中pH下降的程度不同，但與菌株溶磷量無明顯的數(shù)量關系。

表3 有效磷含量及菌液pH值（n=3）

圖1 42株解無機磷細菌的解磷率

2.3 解無機磷細菌生理生化特征

將42株解無機磷菌株進行革蘭氏染色和生理生化實驗測定。結(jié)果顯示，42株解無機磷菌都是革蘭氏陽性細菌，其中接觸酶均為陽性，吲哚反應均為陰性；其淀粉水解、硝酸還原、檸檬酸、精氨酸雙水解、蔗糖發(fā)酵、葡萄糖發(fā)酵、M.R、尿素酶以及明膠反應均呈現(xiàn)不同結(jié)果。

表4 解無機磷菌株的理化特性

續(xù)表

圖2 部分解無機磷菌的16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 16S rDNA測定與系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

結(jié)合形態(tài)觀察和淀粉水解、葡萄糖發(fā)酵及明膠反應等生理生化實驗，進行16S rDNA序列分析。結(jié)果顯示，19株菌株均歸屬于芽孢桿菌屬，初步鑒定菌株Y1-2、Y4-1、Y4-2和Z7-4歸屬于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis），菌株Y1-1、Y5-1、Z8-1歸屬于蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus），菌株Y2-3歸屬于惠州芽孢桿菌（Bacillus huizhouensis），菌株Y8-3歸屬于安全芽孢桿菌（Bacillus safensis），菌 株Y6-1、Z10-1歸 屬 于 短小芽孢桿菌（Bacillus pumil），菌株Y8-1、Y9-1、Z1-1、Z3-4、Z6-1、Z7-1歸屬于阿氏芽孢桿菌（Bacillus aryabhattai），其中阿氏芽孢桿菌（6株解無機磷菌）是優(yōu)勢菌種，其次是蘇云金芽孢桿菌（4株解無機磷菌）。

3 討論

通過解磷圈和鉬銻鈧比色法測定42株解無機磷菌株后發(fā)現(xiàn)，可溶性指數(shù)最高的菌株為Y2-2（D/d為3.65）、增磷量為4.28 mg/L，而增磷量最高的菌株為Z3-4（D/d為2.18）、增磷量為38.55 mg/L。因此，單純從可溶性指數(shù)（解磷圈D與菌落直徑d比值）并不能直接判斷解磷能力，需要結(jié)合培養(yǎng)基中增磷量來預測。

解無機磷細菌可與鐵、鋁、鈣、鎂等離子結(jié)合，使難溶性磷酸鹽溶解釋放磷元素［16］。而分泌有機酸是溶磷微生物溶磷的主要途徑之一，有機酸能夠降低pH［17-18］。發(fā)酵上清液的pH均比種子液pH低，推測解無機磷菌在解磷的過程中與培養(yǎng)基中的Ca3（PO4）2反應，產(chǎn)生了酸性物質(zhì)，從而引起pH的下降，但是詹壽發(fā)等［19］認為培養(yǎng)介質(zhì)的pH下降不是溶磷的必要條件。不同解磷菌的解磷能力不同，導致pH下降的程度存在明顯差異，表明培養(yǎng)基質(zhì)pH的下降與解磷量不呈線性關系［20］。

解無機磷菌的種類較多，目前研究較多的主要有芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單孢菌屬（Pseudomonas）、節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）、色桿菌屬（Chromobacterium）以及分枝桿菌屬（Mycobacterium），主要應用解磷巨大芽孢桿菌生產(chǎn)溶磷菌肥［21-22］。不同土壤中解磷菌的數(shù)量和種群特征存在較大差異，且根際環(huán)境適宜解磷微生物生長，表現(xiàn)出強烈的根際效應［23］。本研究從云南、貴州以及四川中10個不同地區(qū)采集的滇重樓根際土壤中篩選出42株解無機磷菌，經(jīng)鑒定菌株均屬于芽孢桿菌屬，其中阿氏芽孢桿菌為優(yōu)勢菌種。下一步研究將解磷效果最好的菌株Z3-4回接到滇重樓根際土壤并探究解無機磷菌的解磷機制，對開發(fā)生物菌肥具有重要的參考意義。

4 結(jié)論

將20份不同生境滇重樓根際土壤樣本分離純化，獲得42株解無機磷菌，通過解磷能力的定性和定量測定，篩選出解無機磷能力較強的菌株有菌株Y1-1、Y6-1、Y7-1、Y8-3和Z3-4，其中菌株Z3-4的解無機磷能力最強，其發(fā)酵液中的有效磷含量為104.10 mg/L，增磷量達到38.55 mg/L。結(jié)合菌株Z3-4的菌落形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA測序結(jié)果，初步鑒定菌株Z3-4為阿氏芽孢桿菌。